PriCells: 小鼠乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)

實驗材料：

1. 10-12周齡妊娠小鼠乳腺組織

2. 不含Ca2+和Mg2+的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L鏈霉素和200000U/L慶大霉素，pH7.4

3. FBS、含5%牛血清白蛋白（BSA）的PBS液或DMEM

4. 0.05%Ⅰ型膠原酶50ml、0.05%蛋白酶50ml、0.1%DNaseⅠ型、結(jié)晶紫（0.1%）/枸櫞酸（0.1mol/L）

5. 培養(yǎng)液：血清培養(yǎng)液（DMEM或F12+10%FBS）、無血清培養(yǎng)基（DMEM:F12為1：1，加胰島素1-5μg/ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白10μg/ml、BSA1-5mg/ml等）。膠原凝膠鋪底液（酸性膠原液或自制鼠尾膠原，10×F12，用緩沖液稀釋）

6. 分化培養(yǎng)基：為DMEM/F12按1：1（體積比）比例配制的混合培養(yǎng)基，添加5μg/ml胰島素、1μg/ml氫化可de松、3μg/ml催乳素和50μg/ml慶大霉素。其中，催乳素以3μg/ml濃度溶于10mmol/L NaOH中，過濾除菌，4℃下可保存2周，使用前添加到培養(yǎng)基中。

7. C中性蛋白酶溶液：為9.6μg/ml的Dispase溶液，用DMEM配制。

8. 手術(shù)刀、解剖剪、解剖鑷、眼科剪，眼科鑷

9. 離心管（15ml、50ml）、10cm塑料培養(yǎng)皿、300ml有蓋的三角燒瓶（2個，處理膠原酶及蛋白酶用）、高壓滅菌的帶尼龍網(wǎng)（孔徑150μm）的燒杯

10. 厚膠原膠的制備：以8：1：1（體積比）的比例配制鼠尾膠原、F12與NaHCO3/NaOH的混合液作為包被液。包被液的組分包括鼠尾膠原液、10×濃度的F12、0.26mol/L NaHCO3和0.125 mol/L NaOH混合液。分別除菌。將包被液和培養(yǎng)板在4℃下預(yù)冷。然后，按150μl/cm2的用量加到培養(yǎng)器皿內(nèi)。置37℃下1h，用培養(yǎng)液洗2次（每次30min），然后加入血清-胎球蛋白混合液。

實驗方法：

1. 麻醉處死小鼠，75%乙醇消毒，置于蠟板上，用大頭釘固定四肢。用正中線剪開皮膚，用鑷子引開皮膚，用大頭針固定在板上。切下約5g乳腺脂肪組織，放入裝有PBS液的平皿內(nèi)洗滌3次。

2. 用刀片反復(fù)切割、或用剪刀剪碎乳腺至糊狀。然后將組織碎塊移至三角燒瓶內(nèi)，加50ml膠原酶，置37℃恒溫水浴中水平振蕩1-2h（100-200次/min）。

3. 當(dāng)無大片組織塊時，用尼龍網(wǎng)將細(xì)胞濾至燒杯內(nèi)，以除去未消化的組織。濾液移至5ml離心管內(nèi)，1000r/min離心約3min，去上清，加PBS液2ml在手中振搖使細(xì)胞團(tuán)大散，移入裝有50ml膠原酶的三角燒瓶內(nèi)，這時會見部分細(xì)胞懸液中出現(xiàn)云霧狀，經(jīng)10-15min后會消失。放入37℃恒溫水浴中緩慢水平振搖30min（30次/min）。

4. 加10%血清或BSA約5ml，同上法用尼龍網(wǎng)過濾，以1000r/min離心約1min。向細(xì)胞團(tuán)中直接加血清或BSA約1ml，拍擊離心管，打散細(xì)胞團(tuán)（此時細(xì)胞脆弱，一般不進(jìn)行吹打）。移至10ml離心管中，加5mlPBS液混勻，以1000r/min離心約1min，洗滌細(xì)胞3次，可除去成纖維細(xì)胞和紅細(xì)胞。

5. 最后向細(xì)胞團(tuán)中加血清或BSA，打散細(xì)胞團(tuán)，加5-10mlPBS液吹打10次左右，使其成為均一的細(xì)胞懸液，計數(shù)細(xì)胞數(shù)。用此法分離的細(xì)胞多呈塊狀，很難正確計數(shù)，必要時用0.1ml細(xì)胞懸液加0.9ml結(jié)晶紫，劇烈振搖細(xì)胞約1min，此時細(xì)胞易破壞而使胞核著色，可計數(shù)藍(lán)染細(xì)胞核數(shù)。每克組織約可收貨5×106—10×106個細(xì)胞。

6. 得到的細(xì)胞用含10%FBS的DMEM或無血清培養(yǎng)液懸浮，將上述消化的乳腺上皮細(xì)胞以密度為1.0×105—2.5×105個/cm2將其接種在厚膠原膠膜包被的培養(yǎng)板上，加入細(xì)胞分化培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

7. 培養(yǎng)72h，待細(xì)胞融合后，用移液器吸頭或細(xì)胞刮刷將膠原膜與培養(yǎng)板底面分離，使膠原膜收縮并漂浮在培養(yǎng)基中，之后每2-3d更換一次培養(yǎng)液。

8. 細(xì)胞傳代。消化溶液為10×胰蛋白酶-EDTA混合消化液，在37℃下孵育7min。另外，使用中性蛋白酶溶液作為消化液。操作如下：原代細(xì)胞培養(yǎng)后，用DMEM培養(yǎng)基洗培養(yǎng)板，再用1/4稀釋液（2.4μg/ml）的中性蛋白液洗培養(yǎng)板2次。加入100μl/cm2的Dispase溶液，于37℃靜置20min。再加入5%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液以終止消化。

9. 再用含5%胎牛血清的DMEM/F12離心洗滌沉淀細(xì)胞（250r/min，4min）。離心后用5%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞。

10. 將細(xì)胞懸液以1.0×105—2.5×105個/cm2的細(xì)胞密度接種，培養(yǎng)在生長培養(yǎng)基中。如果用于分化培養(yǎng)，接種24-48h后可更換為分化培養(yǎng)基。

11. PriCells-原代上皮細(xì)胞特制基礎(chǔ)培養(yǎng)基

12. PriCells-原代上皮細(xì)胞培養(yǎng)特制添加劑

13. PriCells-原代細(xì)胞分離試劑盒

14. PriCells-原代細(xì)胞鑒定試劑盒