離心技術的應用

　　離心技術（centrifugal technique）是根據(jù)顆粒在作勻速圓周運動時受到一個外向的離心力的行為而發(fā)展起來的一種分離技術。這項技術應用很廣，諸如分離出化學反應后的沉淀物，天然的生物大分子、無機物、有機物，在生物化學以及其它的生物學領域常用來收集細胞、細胞器及生物大分子物質。

　　一、基本原理的分類

　　（一）基本原理

　?、彪x心力（centrifugal force，F(xiàn)c）離心作用是根據(jù)在一定角度速度下作圓周運動的任何物體都受到一個向外的離心力進行的。離心力（Fc）的大小等于離心加速度ω²X與顆粒質量m的乘積，即：

　　其中ω是旋轉角速度，以弧度/秒為單位；X是顆粒離開旋轉中心的距離，以cm為單位；m是質量，以克為單位。

　?、蚕鄬﹄x心力（relative centrifugal force，RCF）由于各種離心機轉子的半徑或者離心管至旋轉軸中心的距離不同，離心力而受變化，因此在文獻中常用“相對離心力”或“數(shù)字×g”表示離心力，只要RCF值不變，一個樣品可以在不同的離心機上獲得相同的結果。

　　RCF就是實際離心場轉化為重力加速度的倍數(shù)。

　　式中X為離心轉子的半徑距離，以cm為單位；g為地球重力加速度（980cm/sec²）；n為轉子每分鐘的轉數(shù)（rpm）。

　　在上式的基礎上，Dole和Cotzias制作了與轉子速度和半徑相對應的離心力的轉換列線圖，見圖16-4，在用圖16-4將離心機轉數(shù)換成相對離心力時，先在離心機半徑標尺上取已知的離心機半徑和在轉數(shù)標尺上取已知的離心機轉數(shù)，然后將這兩點間劃一條直線，在圖中間RCF標尺上的交叉點，即為相應的離心力數(shù)值。例已知離心機轉數(shù)為2500rpm，離心機的半徑為7.7cm，將兩點連接起來交于RCF標尺，此交點500×g即是RCF值。

　?、吵两迪禂?shù)（sedimentation coefficient，s）根據(jù)1924年Svedberg對沉降系數(shù)下的定義：顆粒在單位離心力場中粒子移動的速度。

　　若ω用2πn/60表示，則

　　式中X₁為離心前粒子離旋轉軸的距離；X₂為離心后粒子離旋轉軸的距離。S實際上時常在10^-13秒左右，故把沉降系數(shù)10^-13秒稱為一個Svedberg單位，簡寫S，量綱為秒。

　　⒋沉降速度（sedimentation velocity）沉降速度是指在強大離心力作用下，單位時間內物質運動的距離。

　　式中r為球形粒子半徑；d為球形粒子直徑；η為流體介質的粘度；ρ_P為粒子的密度；ρ_m為介質的密度。

　　從上式可知，粒子的沉降速度與粒子直徑的平方、粒子的密度和介質密度之差成正比；離心力場增大，粒子的沉降速度也增加，將此式代入上項沉降系數(shù)公式中，則S的表示式也可表示為：

　　從該式中可看出，①當ρ_P＞ρ_m，則S＞0，粒子順著離心方向沉降。②當ρ_P＝ρ_m，則S＝0，粒子到達某一位置后達到平衡。③當ρ_P＜ρ_m，則S＜0，粒子逆著離心方向上浮。

　?、党两禃r間（sedimentation time，Ts）在實際工作中，常常遇到要求在已有的離心機上把某一種溶質從溶液中全部沉降分離出來的問題，這就必須首先知道用多大轉速與多長時間可達到目的。如果轉速已知，則需解決沉降時間來確定分離某粒子所需的時間。

　　根據(jù)沉降系數(shù)（S）式可得：

圖16-4　離心力的轉換列線圖

　　將左側r點與右側n點連成一條直線，與中間RCF相交的

　　點即為相對離心力(×g)RCF=1.118×10²×r×n²。

　　積分得

　　式中X₂為離心轉軸中心至離心管底內壁的距離；X₁為離心轉軸至樣品溶液彎月面之間的距離，那么樣品粒子*沉降到底管內壁的時間（t₂－t₁）用Ts表示則式可改為：

　　式中Ts以小時為單位，S以Svedberg為單位。

　?、禟系數(shù)（k factor） K系數(shù)是用來描述在一個轉子中，將粒子沉降下來的效率。也就是溶液恢復成澄清程度的一個指數(shù)，所以也叫“cleaning factor”。原則上，K系數(shù)愈小的，愈容易，也愈快將粒子沉降。

　　其中R_max為轉子zui大半徑；R_min為轉子zui小半徑。由其公式可知，K系數(shù)與離心轉速及粒子沉降的路徑有關。所以K系數(shù)是一個變數(shù)。當轉速廢，或者離心管的溶液量不同，即粒子沉降的路徑改變時，K系數(shù)就改變了。通常，離心機的轉子說明書中提供的K系數(shù)，都是根據(jù)zui大路徑及在zui大轉速下所計算出來的數(shù)值。如果已知粒子的沉降系數(shù)為80S的Polysome，采用的轉子的K系數(shù)是323，那么預計沉降到管底所需的離心時間是T＝k/S＝4h，利用此公式預估的離心時間，對水平式轉子；對固定角式轉子而言，實際時間將比預估的時間來得快些。

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　　根據(jù)離心原理，按照實際工作的需要，目前已設計出許多離心方法，綜合起來大致可分三類。

　　⒈平衡離心法根據(jù)粒子大小、形狀不同進行分離，包括差速離心法（differential velocity centrifugation）和速率區(qū)帶離心法（rate zonal centrifugation）。

　?、驳让芏入x心法（jsopycnic centrifugation）又稱等比重離心法，依粒子密度差進行分離，等密度離心法和上述速率區(qū)帶離心法合稱為密度梯度離心法。

　?、辰?jīng)典式沉降平衡離心法用于對生物大分子分子量的測定、純度估計、構象變化等。

　　二、離心分離方法

　　（一）差速離心法

　　它利用不同的粒子在離心力場中沉降的差別，在同一離心條件下，沉降速度不同，通過不斷增加相對離心力，使一個非均勻混合液內的大小、形狀不同的粒子分部沉淀。操作過程中一般是在離心后用傾倒的辦法把上清液與沉淀分開，然后將上清液加高轉速離心，分離出第二部分沉淀，如此往復加高轉速，逐級分離出所需要的物質。

　　差速離心的分辨率不高，沉淀系數(shù)在同一個數(shù)量級內的各種粒子不容易分開，常用于其他分離手段之前的粗制品提取。

　　例如用差速離心法分離已破碎的細胞各組份

　?。ǘ┧俾蕝^(qū)帶離心法

　　速率區(qū)帶離心法是在離心前于離心管內先裝入密度梯度介質（如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等），待分離的樣品鋪在梯度液的頂部、離心管底部或梯度層中間，同梯度液一起離心。離心后在近旋轉軸處（X₁）的介質密度zui小，離旋轉軸zui遠處（X₂）介質的密度zui大，但zui大介質密度必須小于樣品中粒子的zui小密度，即ρ_P＞ρ_m。這種方法是根據(jù)分離的粒子在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒子處于不同的密度梯度層內分成一系列區(qū)帶，達到彼此分離的目的。梯度液在離心過程中以及離心完畢后，取樣時起著支持介質和穩(wěn)定劑的作用，避免因機械振動而引起已分層的粒子再混合。

　　由于ρ_P＞ρ_m可知S＞0，因此該離心法的離心時間要嚴格控制，既有足夠的時間使各種粒子在介質梯度中形成區(qū)帶，又要控制在任一粒子達到沉淀前。如果離心時間過長，所有的樣品可全部到達離心管底部；離心時間不足，樣品還沒有分離。由于此法是一種不*的沉降，沉降受物質本身大小的影響較大，一般是應用在物質大小相異而密度相同的情況。常用的梯度液有Ficoll、Percoll及蔗糖。

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　　等密度離心法是在離心前預先配制介質的密度梯度，此種密度梯度液包含了被分離樣品中所有粒子的密度，待分離的樣品鋪在梯度液頂上或和梯度液先混合，離心開始后，當梯度液由于離心力的作用逐漸形成底濃而管頂稀的密度梯度，與此同時原來分布均勻的粒子也發(fā)生重新分布。當管底介質的密度大于粒子的密度，即ρ_m＞ρ_P時粒子上浮；在彎頂處ρ_P＞ρ_m時，則粒子沉降，zui后粒子進入到一個它本身的密度位置即ρ_P＝ρ_m，此時dx/dt為零粒子不再移動，粒子形成純組份的區(qū)帶，與樣品粒子的密度有關，而與粒子的大小和其他參數(shù)無關，因此只要轉速、溫度不變，則延長離心時間也不能改變這些粒子的成帶位置。

　　此法一般應用于物質的大小相近，而密度差異較大時。常用的梯度液是CsCl。

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　?、碧荻炔牧系倪x擇原則作為一種理想的梯度材料應具備以下幾點：①與被分離的生物材料不發(fā)生反應即*惰性，且易與所分離的生物粒子分開。②可達到要求的密度范圍，且在所要求的密度范圍內，粘度低，滲透壓低，離子強度和pH變化較小。③不會對離心設備發(fā)生腐蝕作用。④容易純化，價格便宜或容易回收。⑤濃度便于測定，如具有折光率。⑥對于超速離心分析工作來說，它的物理性質、熱力學性質應該是已知的。這些條件是理想條件，*符合每種性能的梯度材料幾乎是沒有的。下面介紹幾種基本上符合上述原則的梯度材料：①糖類：蔗糖、甘油、聚蔗糖（Ficoll）、右旋糖酐、糖原。②無機鹽類：CsCl（氯化銫）、RbCl（氯化銣）、NaCl、KBr等。③有機碘化物：三碘苯甲酰葡萄糖胺（matrizamide）等。④硅溶膠：如Percoll。⑤蛋白質：如牛血清白蛋白。⑥重水。⑦非水溶性有機物：如氟代碳等。

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　?、耪崽牵核苄源?，性質穩(wěn)定，滲透壓較高，其zui高密度可達1.33g/ml，且由于價格低容易制備，是現(xiàn)在實驗室里常用于細胞器、病毒、RNA分離的梯度材料，但由于有較大的滲透壓，不宜用于細胞的分離。

　　⑵聚蔗糖：商品名Ficoll，常采用Ficoll-400也就是相對分子重量為400000，F(xiàn)icoll滲透壓低，但它的粘度卻特別高，為此常與泛影葡胺混合使用以降低粘度。主要用于分離各種細胞包括血細胞、成纖維細胞、腫瘤細胞、鼠肝細胞等。

　?、锹然C：是一種離子性介質、水溶性大，zui高密度可達1.91g/ml。由于它是重金屬鹽類，在離心時形成的梯度有較好的分辨率，被廣泛地用于DNA、質粒、病毒和脂蛋白的分離，但價格較貴。

　　⑷鹵化鹽類：KBr和NaCl可用于脂蛋白分離，KI和NaI可用于RNA分離，其分辨率高于銫鹽。NaCl梯度也可用于分離脂蛋白，NaI梯度可分離天然或變性的DNA。

　?、蒔ercoll：是商品名，它是一種SiO2膠體外面包了一層聚乙烯吡咯酮（PVP），滲透壓低，它對生物材料的影響小，而且顆粒穩(wěn)定，在冷卻和凍融情況下還是穩(wěn)定的，其粘度高，且在酸性pH和高離子強度下不穩(wěn)定。它可用于細胞、細胞器和病毒的分離。

　　三、分析性超速離心

　　與制備性超速離心不同的是：分析性超速離心主要是為了研究生物大分子的沉降特性和結構，而不是專門收集某一特定組份。因此它使用了特殊的轉子和檢測手段，以便連續(xù)監(jiān)視物質在一個離心場中的沉降過程。

　?。ㄒ唬┓治鲂猿匐x心的工作原理

　　分析性超速離心機主要由一個橢圓形的轉子、一套真空系統(tǒng)和一套光學系統(tǒng)所組成。該轉子通過一個柔性的軸聯(lián)接成一個高速的驅動裝置，此軸可使轉子在旋轉時形成自己的軸。轉子在一個冷凍的真空腔中旋轉，其容納二個小室：分析室和配衡室。配衡室是一個經(jīng)過精密加工的金屬塊，作為分析室的平衡用。分析室的容量一般為1ml，呈扇形排列在轉子中，其工作原理與一個普遍水平轉子相同。分析室有上下二個平面的石英窗，離心機中裝有的光學系統(tǒng)可保證在整個離心期間都能觀察小室中正在沉降的物質，可以通過對紫外光的吸收（如對蛋白質和DNA）或折謝率的不同對沉降物進行監(jiān)視。后一方法的原理是：當光線通過一個具有不同密度區(qū)的透明液，在這些區(qū)帶的界面上產生光的折射。在分析室中物質沉降時重粒子和輕粒子之間形成的界面就象一個折射的透鏡，結果在檢測系統(tǒng)的照相底板上產出一“峰”。由于沉降不斷進行，界面向前推進，故“峰”也在移動，從峰移動的速度可以得到物質沉降速度的指標。圖16-5是分析性超速離心系統(tǒng)的示意圖。

　?。ǘ┓治鲂猿匐x心的應用

　?、睖y定生物大分子的相對分子重量測定相對分子重量主要有三種方法：沉降速度、沉降平衡和接近沉降平衡。其中應用zui廣的是沉降速度，超速離心在高速中進行，這個速度使得任意分布的粒子通過溶劑從旋轉的中心輻射地向外移動，在清除了粒子的那部分溶劑和尚含有沉降物的那部分溶劑之間形成一個明顯的界面，該界面隨時間的移動而移動，這就是粒子沉降速度的一個指標，然后用照相記錄，即可求出粒子的沉降系數(shù)。

　　分子或粒子的相對分子重量則可從Svedberg方程式來確定：

圖16-5　分析性超速離心系統(tǒng)圖示

　　式中M：該分子不含水的相對分子重量；R：氣體常數(shù)；T：溫度；S：分子的沉降系數(shù)；ν：分子的微分比容（當一克溶質加到一個大體積的溶液中所占有的體積）；ρ：溶劑的密度。

　?、采锎蠓肿拥募兌裙烙嬱o分析性超速離心已廣泛地應用于研究DNA制劑、病毒和蛋白質的純度。用沉降速度的技術來分析沉降界面是測定制劑均質性的zui常用方法之一，出現(xiàn)單一清晰的界面一般認為是均質的，如有雜質則在主峰的一側或二側出現(xiàn)小峰。

　　⒊分析生物大分子中的構象變化分析性超速離心已成功地用于檢測大分子構象的變化，例如DNA可能以單股或雙股出現(xiàn)，其中每一股在本質上可能是線性的，也可能是環(huán)狀的，如果遇到某種因素（溫度或有機溶劑）DNA分子可能發(fā)生一些構象上的變化，這些變化也許可逆、也許不可逆，這些構象上的變化可以通過檢查樣品在沉降速度上的差異來證實。