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MRM（Multiple Reaction Monitoring，多反應(yīng)監(jiān)測）和PRM（Parallel Reaction Monitoring，平行反應(yīng)監(jiān)測）是兩種靶向定量蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)路線。以下是進行MRM/PRM定量蛋白組學(xué)分析的一般步驟：
一、樣品準備
1.蛋白提?。簭募毎?、組織或其他生物樣品中提取蛋白質(zhì)。
2.蛋白處理：可能包括蛋白還原、烷基化、酶切等步驟，以將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為適合質(zhì)譜分析的肽段。
二、MRM/PRM方法開發(fā)
1.目標(biāo)蛋白和肽段選擇：基于研究目的和已有信息，選擇需要定量的目標(biāo)蛋白和對應(yīng)的特異肽段。
2.同位素標(biāo)記：如需要絕對定量，可使用同位素標(biāo)記的目標(biāo)肽段作為內(nèi)參。
3.MRM/PRM方法建立：利用三重四級桿質(zhì)譜儀（QQQ）或高分辨質(zhì)譜儀（如Orbitrap系列），根據(jù)目標(biāo)肽段的特性，建立MRM或PRM方法。這包括確定母離子、碎裂離子、碰撞能量等參數(shù)。
三、質(zhì)譜分析
1.樣品進樣：將處理好的樣品進入質(zhì)譜儀進行分析。
2.數(shù)據(jù)采集：在MRM模式下，質(zhì)譜儀會針對預(yù)設(shè)的母離子進行篩選、碎裂，并采集選定MS/MS2離子的質(zhì)譜信號。在PRM模式下，則是對目標(biāo)肽段的母離子進行碎裂，并采集二級質(zhì)譜中所有碎片信息。
四、數(shù)據(jù)分析
1.質(zhì)譜數(shù)據(jù)解析：使用專門的數(shù)據(jù)分析軟件（如Skyline）對采集的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行解析，提取目標(biāo)肽段的信號強度。
2.定量結(jié)果計算：根據(jù)同位素標(biāo)記肽段的信號強度，計算目標(biāo)蛋白的絕對定量結(jié)果；或根據(jù)目標(biāo)肽段與內(nèi)參肽段的信號強度比，計算相對定量結(jié)果。
3.生物信息學(xué)分析：對定量結(jié)果進行進一步的生物信息學(xué)分析，如差異表達分析、功能注釋等。
五、結(jié)果驗證與解釋
1.方法驗證：通過對比已知濃度的標(biāo)準品或與其他定量方法（如Western Blot）的結(jié)果進行對比，驗證MRM/PRM方法的準確性和可靠性。
2.結(jié)果解釋：結(jié)合研究背景和生物信息學(xué)分析結(jié)果，對定量結(jié)果進行解釋和討論。
技術(shù)特點與應(yīng)用
MRM技術(shù)：
特點：檢測速度快、離子篩選能力強、儀器穩(wěn)定性好、定量準確性高。
應(yīng)用：適合對特定小群目標(biāo)蛋白進行大批量樣本的定量檢測，尤其是臨床大隊列樣本。
PRM技術(shù)：
特點：操作簡便、檢測成本低、可靶向監(jiān)測的離子數(shù)量多。
應(yīng)用：適合小批量樣本、較多目標(biāo)蛋白靶向定量檢測的實驗需求。
MRM/PRM定量蛋白組學(xué)分析是一種高精準度的蛋白定量鑒定技術(shù)，通過合理的樣品準備、方法開發(fā)、質(zhì)譜分析、數(shù)據(jù)分析和結(jié)果驗證步驟，可以對復(fù)雜樣品中的多個目標(biāo)蛋白進行精準定量研究。
MRM/PRM定量蛋白組學(xué)分析實驗流程
MRM/PRM定量蛋白組學(xué)分析實驗流程
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