使用 Gibco 細胞解離試劑來分離貼壁細胞和組織

為了獲得合適數(shù)量的細胞進行研究，必須先從較大培養(yǎng)物中分離出一組細胞。進入：細胞解離。Gibco 胰蛋白酶和替代細胞解離產(chǎn)品是組織和單層細胞的理想之選。提供多種形式，包括酶促和化學(xué)形式，以滿足研究人員進行貼壁細胞培養(yǎng)的不同需求。探索以下選擇指南，為您的細胞培養(yǎng)類型選擇正確的細胞解離試劑。

胰蛋白酶和細胞蛋白酶化

胰蛋白酶是一種蛋白水解酶，是分離貼壁細胞培養(yǎng)物和單層細胞的標準方法。這種球狀胰腺蛋白酶在賴氨酸和精氨酸的 C 端裂解，分解血管粘附蛋白，并可在細胞收獲過程中輕易重懸。

賽默飛世爾科技提供豬胰蛋白酶，EDTA 增強胰蛋白酶以及 TrypLE 酶制劑的配方，這是一種溫和的胰蛋白酶樣酶。為避免計劃外的蛋白質(zhì)降解，必須使用胰蛋白酶抑制劑滅活有機胰蛋白酶。相比之下，合成胰蛋白酶（如 Gibco TrypLE 產(chǎn)品）通過稀釋滅活，無需額外的溶液。

注：如果細胞培養(yǎng)基中含胎牛血清（FBS），在胰蛋白酶化之前需要用平衡鹽溶液清洗培養(yǎng)物，以確保胰蛋白酶的功能。

胰蛋白酶-EDTA  

EDTA 是一種螯合劑，可提高胰蛋白酶分離貼壁細胞的能力。EDTA 將鈣和鎂結(jié)合成六齒結(jié)構(gòu)，削弱細胞間粘附，增強胰蛋白酶對水解靶向肽鍵的獲取。

Gibco 胰蛋白酶-EDTA 由經(jīng)過電子束驗證的輻照豬源蛋白酶制成，并經(jīng)過 PPV、支原體和 PCV 1/2 污染測試。

幫助實現(xiàn)與 TrypLE 試劑的溫和細胞解離

Gibco TrypLE 試劑是高度純化的重組細胞解離酶，可替代豬胰蛋白酶。這些試劑非常適合在含血清和無血清條件下解離貼壁依賴細胞系，無需更改方案即可直接替代胰蛋白酶。TrypLE 試劑對細胞溫和，在室溫下穩(wěn)定，無動物源性。

TrypLE 酶是血清添加和不含血清條件的理想選擇，是無動物源性胰蛋白酶樣酶的答案。這種酶表現(xiàn)出與胰蛋白酶相似的 pH 值活性譜，在精氨酸和賴氨酸處裂解。由于 TrypLE 酶的無動物來源，消除了潛在致病污染物的危害；并經(jīng)過受控的發(fā)酵過程，TrypLE 酶可以在任何規(guī)模下供應(yīng)。

查看比較圖：胰蛋白酶、胰蛋白酶 EDTA 與 TrypLE 試劑

胰蛋白酶抑制劑

胰蛋白酶抑制劑破壞性地改變胰蛋白酶，使蛋白水解酶與蛋白質(zhì)結(jié)合并消化蛋白質(zhì)的能力失效。胰蛋白酶抑制劑用于解離后，保護細胞免受胰蛋白酶進一步的蛋白質(zhì)降解。

注：大豆胰蛋白酶抑制劑也可結(jié)合胰凝乳蛋白酶，盡管程度較小。

胰蛋白酶抑制劑比較圖

膠原酶

相對溫和的膠原酶以通過消化結(jié)締組織的天然三螺旋膠原纖維而起其作用。這些組織通常存在于皮膚、肌腱、血管和骨骼中—因此膠原酶解聚適用于人類腫瘤、小鼠腎臟、人腦和上皮培養(yǎng)物。

從原代組織中進行細胞分離實驗產(chǎn)品和步驟：

TrypLE™ 產(chǎn)品

TrypLE™ 產(chǎn)品的配方可直接替代您現(xiàn)有的方案。下列通用步驟可用于去除培養(yǎng)皿中多種細胞系，同時保持細胞完整性。應(yīng)根據(jù)經(jīng)驗確定各系統(tǒng)可采用的優(yōu)化條件和濃度。

1. 從培養(yǎng)瓶中慢慢倒出培養(yǎng)基。使用不含鈣和鎂的 5 ml Dulbecco 磷酸緩沖鹽溶液 (D-PBS) 來沖洗培養(yǎng)瓶（Gibco 貨號 14190）。慢慢倒出 D-PBS。

2. 向培養(yǎng)瓶加入適量（即在 75 cm2 培養(yǎng)瓶中加入 2 ml）且預(yù)熱的 TrypLE™。搖動容器，以覆蓋細胞層。

3. 37°C 下孵育直至細胞分離（每 5 分鐘觀察一次）。輕輕敲打容器以清除細胞。

4. 用 2 至 5 ml 細胞培養(yǎng)生長培養(yǎng)基進行稀釋，然后將細胞懸液轉(zhuǎn)移至 15 ml 離心管中。

5. 以 100 × g 離心 5 到 10 分鐘。丟棄上清液，用 2 至 5 ml 新鮮生長培養(yǎng)基懸浮細胞沉淀。

胰蛋白酶

1. 去掉多余的組織后，使用無菌手術(shù)刀或剪刀，將剩余組織切成 3-4 mm 的小塊。將組織塊重懸于不含鈣和鎂的平衡鹽溶液中，進行洗滌。待組織塊沉降，去除上清液。重復(fù)洗滌 2 到 3 次。

2. 將盛有組織塊的容器置于冰上，去除殘留的上清液。在 不含鈣和鎂的平衡鹽溶液中加入 0.25% 的胰蛋白酶（100 mg 組織加入 1 ml 胰蛋白酶）。

3. 在 4°C 下孵育 6 至 18 小時，以大幅度地增加幾乎沒有胰蛋白酶活性的酶的滲透率。

4. 慢慢倒出并丟棄組織塊中的胰蛋白酶。將組織塊以及殘留胰蛋白酶在 37°C 下孵育 20 至 30 分鐘。

5. 向組織塊中加入溫?zé)岬呐囵B(yǎng)基，用移液管上下吹吸輕輕分散組織。如果使用無血清培養(yǎng)基，還要加入大豆胰蛋白酶抑制劑。

6. 通過無菌不銹鋼絲網(wǎng)（100 至 200 µm）過濾細胞懸液，分散剩余組織。計數(shù)和接種細胞，進行培養(yǎng)。

膠原酶

1. 使用無菌手術(shù)刀或剪刀，將組織切成 3-4 mm 的小塊。使用 Hanks 平衡鹽溶液 (HBSS) 洗滌組織塊數(shù)次。

2. 加入膠原酶（50 至 200 單位/ml，溶解在 HBSS 中）。

3. 在 37°C 下孵育 4 至 18 小時。加入 3 mM CaCl2 可增加解離效率。

4. 通過無菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過濾細胞懸液，將分散細胞和組織碎片與較大的組織塊分開。如果需要進一步的解聚 ，在組織塊中加入新鮮的膠原酶。

5. 通過離心在 HBSS 中洗滌懸液數(shù)次。

6. 將細胞沉淀重懸于培養(yǎng)基中。計數(shù)和接種細胞，進行培養(yǎng)。

分散酶

1. 使用無菌手術(shù)刀或剪刀，將組織切成 3-4 mm 的小塊。使用不含鈣和鎂的平衡鹽溶液洗滌組織塊數(shù)次。

2. 加入分散酶（0.6 至 2.4 單位/ml，溶解在不含鈣和鎂的平衡鹽溶液中）。

3. 在 37°C 下孵育 20 分鐘至數(shù)小時。

4. 通過無菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過濾細胞懸液，將分散細胞和組織碎片與較大的組織塊分開。如果需要進一步 的解聚，在組織塊中加入新鮮的分散酶。

5. 通過離心在平衡鹽溶液中洗滌懸液數(shù)次。

為您的細胞類型選擇正確的膠原酶

分散酶

分散酶或中性蛋白酶是多粘芽孢桿菌產(chǎn)生的金屬酶?？焖?、溫和的分散酶可用于收獲和轉(zhuǎn)移正常的二倍體細胞和細胞系。分散酶可有效分離細胞團塊并從完整組織中分裂細胞，對膜完整性或活力幾乎沒有影響。

非酶細胞解離

Versene 溶液

Versene 溶液是 PBS 中的 EDTA 溶液，可溫和、非酶地解離細胞。這種螯合劑將某些細胞類型（如上皮細胞）從血管表面分離以進行懸浮。也可以用作胰蛋白酶消化前的洗滌劑。

非酶細胞解離緩沖液

推薦用于弱貼壁細胞（如上皮細胞），Gibco 細胞解離緩沖液可溫和解離并保持表面蛋白完整性。適合的應(yīng)用包括參與配體結(jié)合的細胞、流式細胞和免疫組織化學(xué)研究。

無酶細胞解離緩沖液實驗方案：

以下是從基質(zhì)中快速移取各種細胞系同時保持細胞完整性的一種常規(guī)程序。此程序并不普遍適用于所有細胞系。應(yīng)根據(jù)經(jīng)驗確定各系統(tǒng)的條件和濃度。 在傳代培養(yǎng)時，應(yīng)定期監(jiān)測細胞活力。細胞活力應(yīng)大于 90%。

1. 使用前將所有試劑加熱至 37°C。

2. 去除細胞中的生長培養(yǎng)基。

3. 沖洗單層細胞，每個 T75 培養(yǎng)瓶或 100 mm 培養(yǎng)皿使用 5 ml 不含 Ca++ 和 Mg++ 的 PBS。輕輕搖動培養(yǎng)瓶（或培養(yǎng)皿），使溶液在室溫下將細胞洗滌30至60秒。吸出沖洗液并丟棄。

4. 重復(fù)步驟3。

5. 每個 T75 培養(yǎng)瓶或 100 mm 培養(yǎng)皿中加入大約 5 ml 細胞解離緩沖液，然后通過在室溫下?lián)u動來輕柔地將細胞洗滌1至2分鐘。您可以在顯微鏡下觀察解離情況。 吸出溶液并丟棄。

6. 用手掌用力拍打培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿，使細胞脫落。如果細胞不能快速脫附，則在室溫下再放置2至5分鐘，再次用手掌用力拍打培養(yǎng)瓶。對于貼壁能力更強的細胞（使用 5 ml 以上的解離緩沖液），可能需要重復(fù)此操作。細胞明顯脫附后，加入至少 5 ml 生長培養(yǎng)基。將細胞重懸于生長培養(yǎng)基中。

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