一、實驗背景

（一）病原體與宿主相互作用研究背景

腸道是人體與外界環(huán)境接觸的重要界面，也是眾多病原體入侵的主要途徑之一。病原體如腸致病性大腸桿菌（EPEC）和腸出血性大腸桿菌（EHEC）等，能夠通過黏附、侵入宿主細胞以及破壞腸道黏膜屏障等方式引發(fā)疾病。

研究病原體與宿主腸道細胞之間的相互作用機制，對于理解感染過程、開發(fā)新型治療方法以及預防措施具有重要意義。傳統(tǒng)研究方法在模擬體內(nèi)環(huán)境方面存在局限性，而類器官技術的發(fā)展為研究病原體與宿主相互作用提供了更接近生理狀態(tài)的模型。

（二）微納塑料毒性、吸收及跨屏障轉運機制研究背景

微納塑料（MNPs）作為一類新型的環(huán)境污染物，廣泛存在于水體、土壤和食物中，并通過食物鏈進入人體。研究表明，微納塑料能夠被腸道吸收并轉運至全身各個器官，可能對人體健康產(chǎn)生潛在危害，如引發(fā)炎癥反應、影響腸道屏障功能、干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)等。

然而，目前對于微納塑料在腸道內(nèi)的毒性作用、吸收機制以及跨屏障轉運的具體過程仍不清楚。利用先進的體外模型系統(tǒng)，如Kirkstall Quasi Vivo類器官串聯(lián)芯片動態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)，能夠更好地模擬人體腸道的生理環(huán)境，有助于深入研究微納塑料的毒性、吸收及跨屏障轉運機制。

二、實驗目的

通過以下實驗方案，可以利用Kirkstall Quasi Vivo類器官串聯(lián)芯片動態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)深入研究病原體與宿主的相互作用以及微納塑料的毒性、吸收及跨屏障轉運機制，為相關領域的研究提供有價值的實驗數(shù)據(jù)和理論支持。

（一）病原體與宿主相互作用研究目的

1. 利用Kirkstall Quasi Vivo類器官串聯(lián)芯片動態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)構建模擬人體腸道的生理環(huán)境，研究病原體與宿主腸道細胞之間的相互作用過程，包括病原體的黏附、侵入、定植以及對宿主細胞功能的影響。

2. 探討病原體分泌的毒素或效應蛋白在感染過程中的作用機制，以及宿主細胞的防御反應，如免疫激活、細胞凋亡等。

3. 評估不同病原體與宿主相互作用的差異，為開發(fā)針對性的治療策略提供理論依據(jù)。

（二）微納塑料毒性、吸收及跨屏障轉運機制研究目的

1. 通過Kirkstall Quasi Vivo類器官串聯(lián)芯片動態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)，研究微納塑料在腸道內(nèi)的毒性效應，包括對腸道上皮細胞的損傷、炎癥反應的誘導以及對腸道屏障功能的影響。

2. 探索微納塑料在腸道內(nèi)的吸收機制，包括其在腸道上皮細胞中的攝取、轉運以及與細胞內(nèi)分子的相互作用。

3. 研究微納塑料跨腸道屏障轉運的機制，揭示其在體內(nèi)分布和潛在危害的關鍵環(huán)節(jié)，為評估微納塑料對人體健康的潛在風險提供科學依據(jù)。

三、實驗材料與設備

（一）實驗材料

1. 病原體與宿主相互作用研究材料

- 病原體：選擇常見的腸道致病菌，如腸致病性大腸桿菌（EPEC）、腸出血性大腸桿菌（EHEC）等標準菌株。

- 宿主細胞：使用人源腸道類器官，可從健康供體或患者組織樣本中分離培養(yǎng)，或者購買商業(yè)化的腸道類器官產(chǎn)品。

- 培養(yǎng)基與試劑：DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、青霉素/鏈霉素（Pen/Strep）、胰蛋白酶-EDTA等常規(guī)細胞培養(yǎng)試劑，以及用于檢測病原體與宿主相互作用的抗體、熒光標記物等。

- 其他材料：Kirkstall Quasi Vivo裝置（用于共培養(yǎng)）、細胞培養(yǎng)板、離心管、移液管等。

2. 微納塑料毒性、吸收及跨屏障轉運機制研究材料

- 微納塑料：選擇不同尺寸、形狀和化學性質(zhì)的微納塑料顆粒，如聚苯乙烯微球、聚乙烯微粒等，可從商業(yè)渠道購買或自行合成。

- 宿主細胞：同樣使用人源腸道類器官，確保其能夠模擬人體腸道的生理結構和功能。

- 培養(yǎng)基與試劑：與病原體研究相同的細胞培養(yǎng)基和試劑，以及用于檢測微納塑料毒性和細胞攝取的試劑，如細胞毒性檢測試劑盒（如CCK-8試劑盒）、熒光標記的微納塑料顆粒、熒光顯微鏡觀察所需的濾光片等。

- 其他材料：Kirkstall Quasi Vivo類器官串聯(lián)芯片系統(tǒng)所需的配件，如芯片、連接管路、培養(yǎng)液儲存器等。

（二）實驗設備

1. 細胞培養(yǎng)設備：超凈工作臺、倒置顯微鏡、離心機、細胞計數(shù)儀等。

2. Kirkstall Quasi Vivo類器官串聯(lián)芯片動態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)：包括芯片、培養(yǎng)液循環(huán)泵、氣體控制系統(tǒng)、溫度控制系統(tǒng)等，用于模擬人體腸道的動態(tài)生理環(huán)境。

3. 檢測設備：熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡、流式細胞儀、酶標儀、實時定量PCR儀、Western blot設備等，用于檢測病原體與宿主相互作用以及微納塑料的毒性、吸收和轉運情況。

四、實驗方法

（一）病原體與宿主相互作用研究方法

1. 腸道類器官的培養(yǎng)與鑒定

（1）從供體組織樣本中分離腸道干細胞，并在含有特定生長因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，形成3D腸道類器官。定期觀察類器官的形態(tài)和生長情況，確保其具有典型的腸道上皮細胞結構和功能。

（2）對培養(yǎng)的腸道類器官進行鑒定，包括免疫熒光染色檢測腸道特異性標志物（如腸上皮細胞標志物E-cadherin、杯狀細胞標志物Muc2等）的表達，以及電鏡觀察類器官的超微結構，確認其與人體腸道組織的相似性。

2. 病原體與腸道類器官的共培養(yǎng)

（1）將培養(yǎng)成熟的腸道類器官轉移到Kirkstall Quasi Vivo類器官串聯(lián)芯片系統(tǒng)中，調(diào)整培養(yǎng)條件，使其適應芯片系統(tǒng)的動態(tài)培養(yǎng)環(huán)境。

（2）將病原體菌液稀釋至適當濃度，加入到腸道類器官培養(yǎng)液中，進行共培養(yǎng)。設置不同的時間點（如1小時、2小時、4小時、8小時等）收集樣本，以便觀察病原體與宿主相互作用的動態(tài)過程。

（3）在共培養(yǎng)過程中，定期觀察腸道類器官的形態(tài)變化，記錄病原體的黏附和侵入情況?？梢允褂脽晒怙@微鏡觀察熒光標記的病原體在腸道類器官中的分布，以及宿主細胞的熒光標記物變化。

3. 病原體與宿主相互作用的檢測

（1）黏附和侵入檢測：通過熒光定量PCR、Western blot等方法檢測病原體在腸道類器官中的數(shù)量變化，反映其黏附和侵入能力。同時，利用共聚焦顯微鏡觀察病原體與宿主細胞的共定位情況，進一步分析其侵入細胞的深度和范圍。

（2）宿主細胞功能檢測：檢測腸道類器官中細胞因子的表達水平，如IL-6、TNF-α等，評估宿主細胞的炎癥反應。通過檢測細胞凋亡標志物（如Caspase-3活性）和細胞增殖標志物（如Ki-67表達），了解病原體對宿主細胞生存和增殖的影響。

（3）腸道屏障功能檢測：使用熒光標記的葡聚糖或FITC-dextran等物質(zhì)，檢測其在腸道類器官中的透過率，評估腸道屏障功能的完整性。同時，通過免疫熒光染色檢測緊密連接蛋白（如ZO-1、occludin）的表達和分布，進一步分析腸道屏障功能的變化。

（二）微納塑料毒性、吸收及跨屏障轉運機制研究方法

1. 腸道類器官的培養(yǎng)與鑒定

（1）與病原體研究相同，培養(yǎng)人源腸道類器官，并進行鑒定，確保其具有良好的生理功能和結構特征，能夠作為研究微納塑料的合適模型。

（2）對腸道類器官進行功能測試，如檢測其對不同營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力、分泌功能以及腸道屏障的完整性，為后續(xù)實驗提供基礎數(shù)據(jù)。

2. 微納塑料暴露與腸道類器官的共培養(yǎng)

（1）將微納塑料顆粒分散在細胞培養(yǎng)液中，制備不同濃度的微納塑料暴露液。根據(jù)預實驗結果，選擇合適的暴露濃度范圍，如10 µg/mL、50 µg/mL、100 µg/mL等。

（2）將腸道類器官轉移到Kirkstall Quasi Vivo類器官串聯(lián)芯片系統(tǒng)中，使其處于動態(tài)培養(yǎng)條件下。將微納塑料暴露液加入到腸道類器官培養(yǎng)液中，進行共培養(yǎng)。設置不同的暴露時間點（如24小時、48小時、72小時等），收集樣本用于后續(xù)分析。

（3）在共培養(yǎng)過程中，觀察腸道類器官的形態(tài)變化，記錄微納塑料在腸道類器官中的分布情況?？梢允褂脽晒怙@微鏡觀察熒光標記的微納塑料顆粒在腸道類器官中的攝取和轉運情況，以及宿主細胞的熒光標記物變化。

Kirkstall Quasi Vivo類器官串聯(lián)芯片系統(tǒng)

3. 微納塑料毒性檢測

（1）細胞毒性檢測：使用細胞毒性檢測試劑盒（如CCK-8試劑盒）檢測微納塑料暴露后腸道類器官的細胞活性變化，評估微納塑料的細胞毒性。同時，通過檢測細胞凋亡標志物（如Annexin V/PI雙染）和細胞壞死標志物（如LDH釋放），進一步了解微納塑料對細胞生存的影響。

（2）炎癥反應檢測：采用ELISA或實時定量PCR等方法檢測微納塑料暴露后腸道類器官中炎癥因子（如IL-6、TNF-α、IL-1β等）的表達水平，評估微納塑料誘導的炎癥反應程度。

（3）氧化應激檢測：通過檢測活性氧（ROS）水平、抗氧化酶（如SOD、CAT）活性以及氧化損傷標志物（如MDA含量），分析微納塑料暴露對腸道類器官氧化應激狀態(tài)的影響。

4. 微納塑料吸收機制研究

（1）細胞攝取實驗：使用熒光標記的微納塑料顆粒，觀察其在腸道類器官中的攝取過程。通過共聚焦顯微鏡觀察微納塑料顆粒在細胞內(nèi)的分布，分析其是否進入細胞內(nèi)特定的細胞器（如溶酶體、線粒體等）。

（2）吸收機制探討：利用不同抑制劑（如抑制內(nèi)吞作用的抑制劑、抑制能量代謝的抑制劑等）處理腸道類器官，觀察微納塑料攝取的變化，推測其吸收機制。例如，使用氯化銨抑制溶酶體酸化，觀察微納塑料在溶酶體中的積累情況；使用2-脫氧-D-葡萄糖抑制細胞能量代謝，檢測微納塑料攝取的變化等。

（3）分子水平研究：通過Western blot或實時定量PCR等方法檢測與微納塑料吸收相關的分子標志物（如內(nèi)吞相關蛋白、細胞骨架蛋白等）的表達變化，進一步揭示微納塑料吸收的分子機制。

5. 微納塑料跨屏障轉運機制研究

（1）屏障完整性檢測：在微納塑料暴露前后，檢測腸道類器官的腸道屏障功能，如檢測緊密連接蛋白的表達和分布、測量跨膜電阻（TEER）值等，評估微納塑料對腸道屏障完整性的影響。

（2）轉運實驗：將熒光標記的微納塑料顆粒加入到腸道類器官的上室培養(yǎng)液中，收集下室培養(yǎng)液，檢測微納塑料的轉運量。通過計算轉運率，評估微納塑料跨腸道屏障的轉運效率。

（3）轉運機制探討：利用不同抑制劑處理腸道類器官，觀察微納塑料轉運的變化，推測其轉運機制。例如，使用抑制緊密連接蛋白的抑制劑、抑制細胞間通道的抑制劑等，分析微納塑料跨屏障轉運的關鍵環(huán)節(jié)。同時，通過檢測細胞內(nèi)信號通路的激活情況（如MAPK信號通路、NF-κB信號通路等），探討微納塑料跨屏障轉運的信號調(diào)控機制。

五、實驗結果分析與討論

（一）病原體與宿主相互作用研究結果分析與討論

1. 黏附和侵入結果分析：通過熒光定量PCR、Western blot和共聚焦顯微鏡觀察等方法得到的病原體黏附和侵入數(shù)據(jù)，分析不同病原體在腸道類器官中的黏附和侵入能力差異。討論病原體表面結構、分泌的毒素或效應蛋白等因素對其黏附和侵入過程的影響，以及宿主細胞的防御機制如何限制病原體的侵入。

2. 宿主細胞功能變化結果分析：細胞因子表達水平、細胞凋亡和增殖標志物的檢測結果，反映了病原體感染對宿主細胞功能的影響。分析病原體誘導的炎癥反應機制，探討細胞凋亡和增殖變化對腸道組織穩(wěn)態(tài)和修復的影響，以及這些變化如何與病原體的致病性相關聯(lián)。

3. 腸道屏障功能變化結果分析：熒光標記葡聚糖透過率和緊密連接蛋白表達分布的檢測結果，揭示了病原體對腸道屏障功能的破壞作用。討論病原體破壞腸道屏障的可能機制，如毒素對緊密連接蛋白的直接作用、宿主細胞炎癥反應對屏障功能的間接影響等，以及腸道屏障功能的破壞如何促進病原體的進一步侵入和感染擴散。

（二）微納塑料毒性、吸收及跨屏障轉運機制研究結果分析與討論

1. 微納塑料毒性結果分析：細胞毒性檢測、炎癥反應檢測和氧化應激檢測結果，綜合評估了微納塑料對腸道類器官的毒性效應。分析不同尺寸、形狀和化學性質(zhì)的微納塑料毒性差異，探討其毒性作用機制，如物理損傷、化學毒性、免疫激活等。討論微納塑料毒性與暴露濃度、暴露時間的關系，以及其對人體健康的潛在危害。

2. 微納塑料吸收結果分析：熒光標記微納塑料顆粒的細胞攝取實驗和吸收機制探討結果，揭示了微納塑料在腸道類器官中的吸收過程和機制。分析微納塑料的吸收途徑，如內(nèi)吞作用、吸附作用等，以及細胞內(nèi)分子標志物的變化如何反映吸收過程。討論微納塑料吸收機制與顆粒特性（如尺寸、表面電荷等）的關系，以及其在體內(nèi)的潛在積累和分布情況。

3. 微納塑料跨屏障轉運結果分析：屏障完整性檢測和轉運實驗結果，評估了微納塑料跨腸道屏障的轉運效率和對屏障功能的影響。分析微納塑料轉運機制，如細胞旁路轉運、細胞內(nèi)轉運等，以及信號通路激活情況如何調(diào)控轉運過程。討論微納塑料跨屏障轉運的潛在風險，如進入血液循環(huán)后的分布和毒性，以及如何通過調(diào)節(jié)腸道屏障功能來降低微納塑料的轉運風險。

六、實驗結論與展望

（一）病原體與宿主相互作用研究結論與展望

1. 結論：總結病原體與宿主腸道細胞相互作用的主要發(fā)現(xiàn)，包括病原體的黏附和侵入機制、宿主細胞的防御反應以及腸道屏障功能的變化等。Kirkstall Quasi Vivo類器官串聯(lián)芯片動態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)在模擬人體腸道生理環(huán)境和研究病原體與宿主相互作用方面的優(yōu)勢，以及本研究對于理解腸道感染機制和開發(fā)新型治療策略的重要意義。

2. 展望：提出未來研究方向，如進一步深入研究病原體分泌的毒素或效應蛋白的作用機制，探索宿主細胞的免疫應答信號通路，以及利用該系統(tǒng)研究其他病原體與宿主相互作用等。建議開展體內(nèi)實驗驗證體外研究結果，以及開發(fā)基于腸道類器官的高通量篩選平臺，用于篩選抗病原體感染的藥物和疫苗。

（二）微納塑料毒性、吸收及跨屏障轉運機制研究結論與展望

1. 結論：總結微納塑料在腸道類器官中的毒性效應、吸收機制和跨屏障轉運機制的主要研究結果。Kirkstall Quasi Vivo類器官串聯(lián)芯片動態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)在研究微納塑料生物效應方面的應用價值，以及本研究對于評估微納塑料人體健康風險和制定相關環(huán)境政策的重要參考意義。

2. 展望：提出未來研究方向，如進一步研究微納塑料在不同生理狀態(tài)下的毒性變化，探索微納塑料與其他環(huán)境污染物的聯(lián)合作用機制，以及利用該系統(tǒng)研究微納塑料對其他器官和組織的影響。建議加強微納塑料在人體內(nèi)的長期暴露研究，以及開發(fā)有效的微納塑料降解和去除技術，以減少其對環(huán)境和人體健康的危害。

七、實驗注意事項與建議

（一）病原體與宿主相互作用研究注意事項與建議

1. 病原體處理：在操作病原體時，嚴格遵守生物安全規(guī)定，佩戴適當?shù)姆雷o裝備，防止病原體污染和傳播。確保病原體的純度和活性，避免因病原體污染或失活影響實驗結果。

2. 類器官培養(yǎng)：優(yōu)化腸道類器官的培養(yǎng)條件，確保其具有良好的生理功能和結構特征。定期觀察類器官的生長狀態(tài)，及時調(diào)整培養(yǎng)液成分和培養(yǎng)條件，以維持類器官的穩(wěn)定性和一致性。

3. 共培養(yǎng)條件：在病原體與腸道類器官共培養(yǎng)過程中，注意控制病原體的感染復數(shù)（MOI），避免過高或過低的感染復數(shù)影響實驗結果的解讀。同時，確保共培養(yǎng)系統(tǒng)的穩(wěn)定性和動態(tài)性，模擬人體腸道的生理環(huán)境。

4. 檢測方法選擇：根據(jù)研究目的選擇合適的檢測方法，如熒光定量PCR、Western blot、免疫熒光染色等。確保檢測方法的靈敏度和特異性，避免假陽性或假陰性結果。同時，結合多種檢測方法，從不同角度分析病原體與宿主相互作用的機制。

（二）微納塑料毒性、吸收及跨屏障轉運機制研究注意事項與建議

1. 微納塑料制備：在制備微納塑料暴露液時，確保微納塑料顆粒的均勻分散，避免顆粒聚集影響實驗結果。可以使用超聲處理、表面修飾等方法提高微納塑料的分散性。同時，嚴格控制微納塑料的濃度和暴露時間，確保實驗條件的可重復性。

2. 類器官暴露：在微納塑料暴露過程中，注意觀察腸道類器官的形態(tài)變化和生理功能，避免過高濃度或過長時間的暴露導致類器官的過度損傷。定期更換培養(yǎng)液，確保微納塑料暴露液的穩(wěn)定性。

3. 檢測方法優(yōu)化：對于微納塑料的毒性、吸收和轉運檢測，選擇合適的熒光標記物和檢測指標，確保檢測結果的準確性和可靠性。在使用抑制劑研究吸收和轉運機制時，注意抑制劑的濃度和作用時間，避免抑制劑對細胞產(chǎn)生非特異性毒性。

4. 實驗重復與統(tǒng)計分析：進行多次實驗重復，確保實驗結果的穩(wěn)定性和可靠性。在數(shù)據(jù)分析時，采用適當?shù)慕y(tǒng)計方法，如單因素方差分析（ANOVA）、t檢驗等，對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，得出具有統(tǒng)計學意義的結論。

公司主營產(chǎn)品：

Kilby 3D-clinostat 旋轉細胞培養(yǎng)儀，

Kilby Gravity 微/超重力三維細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，

3D回轉重力環(huán)境模擬系統(tǒng)，隨機定位儀，

類器官芯片搖擺灌注儀，

Kirkstall 類器官串聯(lián)芯片灌流仿生構建系統(tǒng)