液相色譜儀工作原理

一、基本原理：分配系數(shù)差異驅(qū)動(dòng)分離

1. 固定相：色譜柱內(nèi)填充的多孔顆粒材料（如硅膠、聚合物等），根據(jù)分離模式（反相、正相、離子交換等）具有不同極性或化學(xué)特性。

2. 流動(dòng)相：攜帶樣品通過(guò)色譜柱的液體（如甲醇、乙腈、緩沖鹽溶液等），其極性和組成可調(diào)節(jié)分離效果。

3. 分離機(jī)制：

• 樣品注入后，各組分在流動(dòng)相推動(dòng)下進(jìn)入色譜柱。

• 極性低的組分與非極性固定相（如 C18）作用力強(qiáng)，在柱內(nèi)保留時(shí)間長(zhǎng)；極性高的組分與固定相作用力弱，隨流動(dòng)相快速流出。

• 不同組分因分配系數(shù)差異，在柱內(nèi)遷移速度不同，最終按順序流出色譜柱，實(shí)現(xiàn)分離。

二、核心組件與功能

1. 輸液系統(tǒng)

• 高壓泵：提供穩(wěn)定流量的流動(dòng)相（壓力可達(dá)幾十兆帕），確保樣品在柱內(nèi)快速遷移。

• 溶劑管理器：混合多種流動(dòng)相（如梯度洗脫），精確控制比例和流速。

2. 進(jìn)樣系統(tǒng)

• 進(jìn)樣器：將樣品定量注入流動(dòng)相（如手動(dòng)進(jìn)樣閥或自動(dòng)進(jìn)樣器），避免外界干擾。

3. 分離系統(tǒng)

• 色譜柱：核心部件，內(nèi)徑通常 1-4.6 mm，長(zhǎng)度 50-250 mm，固定相填充其中。不同類(lèi)型色譜柱（如反相柱、親水作用柱）適用于不同樣品。

4. 檢測(cè)系統(tǒng)

• 紫外 - 可見(jiàn)檢測(cè)器（UV-Vis）：檢測(cè)有紫外吸收的組分（如芳香族化合物）

• 示差折光檢測(cè)器（RID）：通過(guò)折射率變化檢測(cè)無(wú)紫外吸收的物質(zhì)（如糖類(lèi)），但靈敏度較低。

• 熒光檢測(cè)器：檢測(cè)熒光物質(zhì)（如維生素、藥物代謝物），靈敏度高。

• 質(zhì)譜檢測(cè)器（LC-MS）：與質(zhì)譜聯(lián)用，提供分子結(jié)構(gòu)信息，適用于復(fù)雜樣品分析。

5. 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)

• 記錄色譜峰的保留時(shí)間、峰面積等參數(shù)，通過(guò)軟件計(jì)算組分含量或純度。

三、關(guān)鍵分離模式與應(yīng)用場(chǎng)景

1. 反相色譜（RP-HPLC）

• 固定相：非極性（如 C18、C8），流動(dòng)相為極性溶劑（水 + 甲醇 / 乙腈）。

• 應(yīng)用：分離極性中等至非極性化合物（如藥物、脂肪酸、激素）

2. 正相色譜（NP-HPLC）

• 固定相：極性（如硅膠、氨基柱），流動(dòng)相為非極性溶劑（正己烷、異丙醇）。

• 應(yīng)用：分離極性化合物（如糖類(lèi)、甘油酯、手性異構(gòu)體）。

3. 離子交換色譜（IEC）

• 固定相：帶電荷基團(tuán)（如磺酸基、季銨基），通過(guò)靜電作用分離離子型物質(zhì)（如氨基酸、核酸、有機(jī)酸）。

4. 尺寸排阻色譜（SEC）

• 固定相：多孔凝膠，按分子尺寸分離（大分子先流出，小分子后流出），用于聚合物分子量分析、蛋白質(zhì)純化等。

四、典型工作流程

1. 系統(tǒng)平衡：用初始流動(dòng)相沖洗色譜柱，直至基線(xiàn)穩(wěn)定。

2. 樣品進(jìn)樣：通過(guò)進(jìn)樣器將樣品注入流路，隨流動(dòng)相進(jìn)入色譜柱。

3. 分離過(guò)程：組分在柱內(nèi)按分配系數(shù)差異先后流出色譜柱。

4. 檢測(cè)與記錄：檢測(cè)器實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)流出組分，生成色譜圖（橫坐標(biāo)為保留時(shí)間，縱坐標(biāo)為信號(hào)強(qiáng)度）。

5. 結(jié)果分析：根據(jù)保留時(shí)間定性（與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比），峰面積或峰高定量（外標(biāo)法、內(nèi)標(biāo)法）。

五、優(yōu)勢(shì)與局限性

• 優(yōu)勢(shì)：

• 分離效率高，可分析復(fù)雜混合物（如中藥提取物、生物樣品）。

• 檢測(cè)靈敏度高（UV 檢測(cè)器可達(dá)微克級(jí)，MS 檢測(cè)器可達(dá)皮克級(jí)）。

• 流動(dòng)相選擇靈活，適用于極性 / 非極性、熱不穩(wěn)定化合物（無(wú)需高溫汽化，優(yōu)于氣相色譜）。

• 局限性：

• 樣品需溶解于液體，不能直接分析氣體或固體。

• 色譜柱易被污染，需定期維護(hù)。

• 梯度洗脫時(shí)，流動(dòng)相更換和平衡時(shí)間較長(zhǎng)。

六、應(yīng)用領(lǐng)域

• 制藥行業(yè)：藥物純度檢測(cè)、雜質(zhì)分析、手性分離（如布洛芬對(duì)映體）。

• 環(huán)境監(jiān)測(cè)：水中農(nóng)藥殘留（如有機(jī)磷、除草劑）、多環(huán)芳烴（PAHs）分析。

• 食品分析：添加劑（如防腐劑、色素）、維生素、真菌毒素（如黃曲霉毒素）檢測(cè)。

• 生物化學(xué)：蛋白質(zhì)分離（如單抗藥物）、核酸純化、代謝物分析（如 LC-MS 代謝組學(xué)）。

液相色譜儀通過(guò)精準(zhǔn)控制分離條件，實(shí)現(xiàn)了復(fù)雜樣品的高效分析，其技術(shù)不斷向高速度（如超高效液相色譜 UPLC）、高靈敏度（如聯(lián)用質(zhì)譜）方向發(fā)展，成為現(xiàn)代分析化學(xué)的核心工具之一。