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免疫熒光概述

我們在細(xì)胞成像領(lǐng)域深耕近50年，可為您提供值得信賴的研究工具和方案，幫助您實驗即可獲取高品質(zhì)的細(xì)胞圖像。Invitrogen™成像試劑和抗體經(jīng)過廣泛驗證，享有認(rèn)可度，且在已發(fā)表研究中被頻繁引用。

賽默飛提供免疫熒光產(chǎn)品，請訪問獲取產(chǎn)品最新信息。

無論您是剛開始進(jìn)行細(xì)胞成像，或者已經(jīng)富有經(jīng)驗，都可使用以下經(jīng)過驗證的五步法流程，確保輕松獲取發(fā)表級細(xì)胞圖像。

五步法高品質(zhì)固定細(xì)胞成像

遵照如下5個步驟采集盡可能的固定細(xì)胞圖像，即使您第一次使用也可獲得可供發(fā)表的高品質(zhì)細(xì)胞圖像。

步驟一：細(xì)胞和組織樣品處理

準(zhǔn)備熒光標(biāo)記的細(xì)胞樣品

為實現(xiàn)最佳的圖像質(zhì)量，首先應(yīng)建立針對目的蛋白和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的研究，同時將其他一切背景等排除在圖像之外。固定和破膜細(xì)胞樣品用于標(biāo)記 – 首先將細(xì)胞結(jié)構(gòu)、蛋白和核酸固定，然后使熒光染料和抗體滲入到細(xì)胞內(nèi)部，標(biāo)記目的靶點。封閉細(xì)胞樣品，防止熒光標(biāo)記物與研究無關(guān)的蛋白非特異性結(jié)合，最大限度提高信噪比。

固定液將細(xì)胞結(jié)構(gòu)鎖定。

透化作用可去除細(xì)胞膜脂質(zhì) - 使標(biāo)記和檢測試劑能夠穿過膜孔到達(dá)細(xì)胞內(nèi)部。

蛋白封閉液有助于減少非特異染色。抗體能夠取代封閉蛋白與其表位形成高親和力結(jié)合，而封閉液可防止樣品中的低親和力結(jié)合。

在固定和破膜之后，使用NucBlue活細(xì)胞染料及ActinGreen 488 ReadyProbes即用型試劑對U2OS細(xì)胞進(jìn)行染色。圖A采用傳統(tǒng)甲醇溶液方法固定，圖B則采用基于甲醛優(yōu)化配方的Image-iT固定/透化試劑盒固定。對比可發(fā)現(xiàn)，圖A中甲醇固定的方法可導(dǎo)致肌動蛋白細(xì)胞骨架斷裂和細(xì)胞破碎，而Image-iT 固定/透化試劑盒則可為絕大多數(shù)細(xì)胞類型提供最佳固定條件。

步驟二：標(biāo)記樣品

使用細(xì)胞器特異性染料、探針和一抗檢測細(xì)胞結(jié)構(gòu)和蛋白

通過不同顏色熒光標(biāo)記不同的靶標(biāo)，可以直觀的觀察同一樣品細(xì)胞內(nèi)不同結(jié)構(gòu)和蛋白。熒光標(biāo)記靶標(biāo)的方法主要包括熒光染料、免疫標(biāo)記、熒光融合蛋白等——這幾種方法均可選擇性標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)和蛋白，讓您在成像時更輕松地進(jìn)行觀察。細(xì)胞生物學(xué)采用的很多熒光工具基本上都是熒光基團(tuán)。這些熒光基團(tuán)經(jīng)過不同的方法修飾或結(jié)合到不同的分子上，從而具備了某些的功能與特定的細(xì)胞器或蛋白結(jié)合。通過化學(xué)修飾，單個熒光基團(tuán)可以產(chǎn)生許多變體形式，且每種變體都有不同的特異性。例如，發(fā)出綠色熒光的Invitrogen Alexa Fluor 488染料分子經(jīng)過修飾后，可以靶向肌動蛋白微絲，可以結(jié)合IgG用于免疫標(biāo)記，還可用作全細(xì)胞染料。Invitrogen提供了超過51000種高品質(zhì)一抗，其中的部分抗體可以直接結(jié)合大量明亮的熒光染料和標(biāo)記物，包括Invitrogen Alexa Fluor染料系列。

免疫熒光標(biāo)記推薦產(chǎn)品

Invitrogen提供了100,000多種高質(zhì)量的一抗，覆蓋85%以上的蛋白靶點。其中涵蓋一些抗體直標(biāo)熒光標(biāo)記物和標(biāo)簽產(chǎn)品，包括Invitrogen的Alexa Fluor染料。

單個熒光基團(tuán)可以進(jìn)行任意數(shù)量的標(biāo)記，包括用于標(biāo)記細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分的功能化形式，例如（A）肌動蛋白、（B）微管蛋白和（C）Hydrazide全細(xì)胞標(biāo)記。

采用Invitrogen Image-iT 固定/透化試劑盒制備染色用的培養(yǎng)細(xì)胞，然后采用Invitrogen BlockAid封閉液處理。先采用能識別線粒體的一抗標(biāo)記樣品，然后與Alexa Fluor 750 染料標(biāo)記的二抗 （紫色），Invitrogen NucBlue細(xì)胞核染料（藍(lán)色） 和Invitrogen ActinGreen 488即用型試劑（綠色）孵育。在Invitrogen EVOS FL全自動細(xì)胞成像系統(tǒng)上采集圖像。

步驟三：檢測樣品

優(yōu)化熒光信號，保證免疫熒光結(jié)果

檢測復(fù)雜的生物學(xué)結(jié)構(gòu)需要最高清晰度的熒光信號，并將熒光信號從背景噪聲中分離開來。標(biāo)準(zhǔn)的免疫熒光標(biāo)記很少能夠獲得最佳信噪比的成像效果。獲得良好圖片的可供發(fā)表的高質(zhì)量圖像之間的差異就在于：需要精細(xì)調(diào)整樣品信號達(dá)到峰值特異性、高清晰度和最佳放大倍數(shù)。

固定和破膜HeLa細(xì)胞，采用Image-iT固定/透化試劑盒之中的試劑處理，與抗微管蛋白一抗及Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG (H+L) 二抗一同孵育。然后將細(xì)胞與抗ATP 合成酶亞型 IF1 抗體一同孵育，并采用Alexa Fluor 594 Tyramide SuperBoost 試劑盒（山羊抗小鼠IgG 和 Alexa Fluor 594酪胺）中的試劑進(jìn)行標(biāo)記。用NucBlue 可固定細(xì)胞即用型染料標(biāo)記細(xì)胞核。采用共聚焦顯微鏡采集圖像。

中等至高豐度的蛋白靶標(biāo)

二抗可用于間接檢測目的抗原。一抗與靶標(biāo)直接結(jié)合，而二抗則以一抗為橋梁，間接結(jié)合目標(biāo)生物分子。這種方法可以放大信號，提高靈敏度，最大限度的檢測出靶標(biāo)。

一抗（橙色和黃色）與靶表位結(jié)合后，熒光標(biāo)記的二抗（紫色和藍(lán)色）結(jié)合特異性的一抗。

中等至低豐度的蛋白靶標(biāo)

鏈霉親和素結(jié)合物可以提高標(biāo)記靶標(biāo)的熒光基團(tuán)的數(shù)量，從而放大信號。基于鏈霉親和素信號放大技術(shù)廣泛應(yīng)用于熒光成像，用以提高一抗和二抗檢測的靈敏度。

使用熒光基團(tuán)-鏈霉親和素標(biāo)記的抗體可以增強(qiáng)信號，因為更多的熒光基團(tuán)可以與單個抗體分子結(jié)合，從而放大信號。

低豐度蛋白靶標(biāo)

對于傳統(tǒng)方法無法檢測到的低豐度蛋白靶標(biāo)，酪胺信號放大技術(shù)(TSA)可以在不降低分辨率的前提下，進(jìn)行靈敏的檢測。TSA技術(shù)采用了一種能在過氧化氫存在的條件下釋放活性染料的酶，從而使靶標(biāo)明顯且清晰的與背景區(qū)分開。

酪胺信號放大技術(shù)在不影響分辨率的情況下獲取優(yōu)質(zhì)的靈敏度。

免疫熒光檢測推薦產(chǎn)品

與Alexa Fluor染料相比，Alexa Fluor Plus二抗采用專有的技術(shù)，信噪比高達(dá)4.2倍，為檢測低豐度靶標(biāo)提供了更高的靈敏度。

Invitrogen Tyramide SuperBoost試劑盒采用 Invitrogen SuperBoost 技術(shù)，為低豐度蛋白靶標(biāo)提供免疫熒光檢測方法。SuperBoost試劑盒的靈敏度是標(biāo)準(zhǔn)免疫化學(xué)（ICC）、免疫組織化學(xué)（IHC）和原位雜交（ISH）方法的10-200倍，可為低豐度靶標(biāo)的高分辨成像提供優(yōu)質(zhì)的信號放大、定義和清晰度。SuperBoost試劑將Alexa Fluor染料的亮度與值得信賴的poly-HRP酪胺信號放大技術(shù)結(jié)合，使靈敏度比標(biāo)準(zhǔn)處理方法高2-10倍，包括其他供應(yīng)商的試劑。

步驟四：保護(hù)樣品

避免熒光信號發(fā)生光漂白，提高免疫熒光圖像質(zhì)量

雖然熒光基團(tuán)是進(jìn)行高質(zhì)量細(xì)胞成像，但不可避免地也極易發(fā)生光漂白，即熒光信號的光化學(xué)降解或衰退。任何光敏感度的下降都可能導(dǎo)致數(shù)據(jù)出現(xiàn)偏差，產(chǎn)生假性結(jié)果?？勾銣绶馄瑒┛梢员Ｗo(hù)熒光標(biāo)記蛋白的穩(wěn)定性，維持?jǐn)?shù)周乃至數(shù)月的圖像信號完整度。

推薦產(chǎn)品

Invitrogen ProLong Glass抗淬滅封片劑的設(shè)計旨在為整個可見和近紅外光譜內(nèi)提供抗淬滅保護(hù)。ProLong Glass封片劑的折射率為1.52，可與多種熒光染料一起用于幾乎所有細(xì)胞以及深度范圍為0.1 µm至150 µm的組織樣品，獲得明亮、高分辨率的Z-stack、3D和2D圖像。由于減少了圖像失真，其在油鏡和共聚焦顯微鏡下也能很好地工作。

ProLong抗淬滅封片劑用于固定細(xì)胞成像具有以下好處：

· 即使在長時間儲存后，仍可以在整個光譜范圍內(nèi)抑制光漂白

· 在整個光譜范圍內(nèi)的背景都很低

· 固化封片劑

· 可選含有或不含DAPI兩種形式

· 即用型隨取隨用優(yōu)化配方

· 可根據(jù)您的需求選擇折射率：ProLong Glass試劑為1.52，ProLong Diamond和ProLong Gold試劑為1.47

60秒延時成像顯示，使用ProLong抗淬滅封片劑能夠提高對光漂白的抵抗性。使用FITC鬼筆環(huán)肽標(biāo)記固定的HeLa細(xì)胞，并使用ProLong Glass試劑、ProLong Diamond試劑、ProLong Gold試劑或50% PBS/甘油封片。在使用標(biāo)準(zhǔn)100瓦汞弧燈連續(xù)照明的條件下，使用20倍物鏡以12秒間隔采集圖像。

步驟五：樣品成像

保證您的免疫熒光結(jié)果具有分辨率和清晰度

通過采集最高清晰度圖像突破研究新發(fā)現(xiàn)。在當(dāng)今激烈的科研競爭環(huán)境下，能否快速獲得可供發(fā)表的高質(zhì)量圖像是決定您成敗的關(guān)鍵。想要獲取最頂級的圖像，就需要配備頂級成像元件的成像平臺，包括：

· 高性相機(jī)和光學(xué)元件，快速采集高分辨率圖像

· 全新一代LED光立方，擁有信噪比表現(xiàn)

· 功能強(qiáng)大的圖像采集和分析軟件，輕松采集發(fā)表級的圖像數(shù)據(jù)

免疫熒光成像推薦產(chǎn)品

選擇簡單易用的模塊化系統(tǒng)，可以根據(jù)您的實驗需求進(jìn)行調(diào)整。我們提供可定制的20多種Invitrogen EVOS LED光立方、容器支架和物鏡等，涵蓋廣泛的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜。

需要在提高樣品通量的同時獲取更多定量數(shù)據(jù)？Celllnsight CX5高內(nèi)涵篩選平臺提供自動圖像采集與同步數(shù)據(jù)分析，讓您在5分鐘內(nèi)分析多達(dá)50萬個表型細(xì)胞。

顯微鏡

高內(nèi)涵分析

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