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使用 Gibco 細(xì)胞解離試劑來(lái)分離貼壁細(xì)胞和組織

為了獲得合適數(shù)量的細(xì)胞進(jìn)行研究，必須先從較大培養(yǎng)物中分離出一組細(xì)胞。進(jìn)入：細(xì)胞解離。Gibco 胰蛋白酶和替代細(xì)胞解離產(chǎn)品是組織和單層細(xì)胞的理想之選。提供多種形式，包括酶促和化學(xué)形式，以滿(mǎn)足研究人員進(jìn)行貼壁細(xì)胞培養(yǎng)的不同需求。探索以下選擇指南，為您的細(xì)胞培養(yǎng)類(lèi)型選擇正確的細(xì)胞解離試劑。

胰蛋白酶和細(xì)胞蛋白酶化

胰蛋白酶是一種蛋白水解酶，是分離貼壁細(xì)胞培養(yǎng)物和單層細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)方法。這種球狀胰腺蛋白酶在賴(lài)氨酸和精氨酸的 C 端裂解，分解血管粘附蛋白，并可在細(xì)胞收獲過(guò)程中輕易重懸。

賽默飛世爾科技提供豬胰蛋白酶，EDTA 增強(qiáng)胰蛋白酶以及 TrypLE 酶制劑的配方，這是一種溫和的胰蛋白酶樣酶。為避免計(jì)劃外的蛋白質(zhì)降解，必須使用胰蛋白酶抑制劑滅活有機(jī)胰蛋白酶。相比之下，合成胰蛋白酶（如 Gibco TrypLE 產(chǎn)品）通過(guò)稀釋滅活，無(wú)需額外的溶液。

注：如果細(xì)胞培養(yǎng)基中含胎牛血清（FBS），在胰蛋白酶化之前需要用平衡鹽溶液清洗培養(yǎng)物，以確保胰蛋白酶的功能。

胰蛋白酶-EDTA  

EDTA 是一種螯合劑，可提高胰蛋白酶分離貼壁細(xì)胞的能力。EDTA 將鈣和鎂結(jié)合成六齒結(jié)構(gòu)，削弱細(xì)胞間粘附，增強(qiáng)胰蛋白酶對(duì)水解靶向肽鍵的獲取。

Gibco 胰蛋白酶-EDTA 由經(jīng)過(guò)電子束驗(yàn)證的輻照豬源蛋白酶制成，并經(jīng)過(guò) PPV、支原體和 PCV 1/2 污染測(cè)試。

幫助實(shí)現(xiàn)與 TrypLE 試劑的溫和細(xì)胞解離

Gibco TrypLE 試劑是高度純化的重組細(xì)胞解離酶，可替代豬胰蛋白酶。這些試劑非常適合在含血清和無(wú)血清條件下解離貼壁依賴(lài)細(xì)胞系，無(wú)需更改方案即可直接替代胰蛋白酶。TrypLE 試劑對(duì)細(xì)胞溫和，在室溫下穩(wěn)定，無(wú)動(dòng)物源性。

TrypLE 酶是血清添加和不含血清條件的理想選擇，是無(wú)動(dòng)物源性胰蛋白酶樣酶的答案。這種酶表現(xiàn)出與胰蛋白酶相似的 pH 值活性譜，在精氨酸和賴(lài)氨酸處裂解。由于 TrypLE 酶的無(wú)動(dòng)物來(lái)源，消除了潛在致病污染物的危害；并經(jīng)過(guò)受控的發(fā)酵過(guò)程，TrypLE 酶可以在任何規(guī)模下供應(yīng)。

查看比較圖：胰蛋白酶、胰蛋白酶 EDTA 與 TrypLE 試劑

胰蛋白酶抑制劑

胰蛋白酶抑制劑破壞性地改變胰蛋白酶，使蛋白水解酶與蛋白質(zhì)結(jié)合并消化蛋白質(zhì)的能力失效。胰蛋白酶抑制劑用于解離后，保護(hù)細(xì)胞免受胰蛋白酶進(jìn)一步的蛋白質(zhì)降解。

注：大豆胰蛋白酶抑制劑也可結(jié)合胰凝乳蛋白酶，盡管程度較小。

胰蛋白酶抑制劑比較圖

膠原酶

相對(duì)溫和的膠原酶以通過(guò)消化結(jié)締組織的天然三螺旋膠原纖維而起其作用。這些組織通常存在于皮膚、肌腱、血管和骨骼中—因此膠原酶解聚適用于人類(lèi)腫瘤、小鼠腎臟、人腦和上皮培養(yǎng)物。

從原代組織中進(jìn)行細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)產(chǎn)品和步驟：

TrypLE™ 產(chǎn)品

TrypLE™ 產(chǎn)品的配方可直接替代您現(xiàn)有的方案。下列通用步驟可用于去除培養(yǎng)皿中多種細(xì)胞系，同時(shí)保持細(xì)胞完整性。應(yīng)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定各系統(tǒng)可采用的優(yōu)化條件和濃度。

1. 從培養(yǎng)瓶中慢慢倒出培養(yǎng)基。使用不含鈣和鎂的 5 ml Dulbecco 磷酸緩沖鹽溶液 (D-PBS) 來(lái)沖洗培養(yǎng)瓶（Gibco 貨號(hào) 14190）。慢慢倒出 D-PBS。

2. 向培養(yǎng)瓶加入適量（即在 75 cm2 培養(yǎng)瓶中加入 2 ml）且預(yù)熱的 TrypLE™。搖動(dòng)容器，以覆蓋細(xì)胞層。

3. 37°C 下孵育直至細(xì)胞分離（每 5 分鐘觀(guān)察一次）。輕輕敲打容器以清除細(xì)胞。

4. 用 2 至 5 ml 細(xì)胞培養(yǎng)生長(zhǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋?zhuān)缓髮⒓?xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至 15 ml 離心管中。

5. 以 100 × g 離心 5 到 10 分鐘。丟棄上清液，用 2 至 5 ml 新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞沉淀。

胰蛋白酶

1. 去掉多余的組織后，使用無(wú)菌手術(shù)刀或剪刀，將剩余組織切成 3-4 mm 的小塊。將組織塊重懸于不含鈣和鎂的平衡鹽溶液中，進(jìn)行洗滌。待組織塊沉降，去除上清液。重復(fù)洗滌 2 到 3 次。

2. 將盛有組織塊的容器置于冰上，去除殘留的上清液。在 不含鈣和鎂的平衡鹽溶液中加入 0.25% 的胰蛋白酶（100 mg 組織加入 1 ml 胰蛋白酶）。

3. 在 4°C 下孵育 6 至 18 小時(shí)，以大幅度地增加幾乎沒(méi)有胰蛋白酶活性的酶的滲透率。

4. 慢慢倒出并丟棄組織塊中的胰蛋白酶。將組織塊以及殘留胰蛋白酶在 37°C 下孵育 20 至 30 分鐘。

5. 向組織塊中加入溫?zé)岬呐囵B(yǎng)基，用移液管上下吹吸輕輕分散組織。如果使用無(wú)血清培養(yǎng)基，還要加入大豆胰蛋白酶抑制劑。

6. 通過(guò)無(wú)菌不銹鋼絲網(wǎng)（100 至 200 µm）過(guò)濾細(xì)胞懸液，分散剩余組織。計(jì)數(shù)和接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)。

膠原酶

1. 使用無(wú)菌手術(shù)刀或剪刀，將組織切成 3-4 mm 的小塊。使用 Hanks 平衡鹽溶液 (HBSS) 洗滌組織塊數(shù)次。

2. 加入膠原酶（50 至 200 單位/ml，溶解在 HBSS 中）。

3. 在 37°C 下孵育 4 至 18 小時(shí)。加入 3 mM CaCl2 可增加解離效率。

4. 通過(guò)無(wú)菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸液，將分散細(xì)胞和組織碎片與較大的組織塊分開(kāi)。如果需要進(jìn)一步的解聚 ，在組織塊中加入新鮮的膠原酶。

5. 通過(guò)離心在 HBSS 中洗滌懸液數(shù)次。

6. 將細(xì)胞沉淀重懸于培養(yǎng)基中。計(jì)數(shù)和接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)。

分散酶

1. 使用無(wú)菌手術(shù)刀或剪刀，將組織切成 3-4 mm 的小塊。使用不含鈣和鎂的平衡鹽溶液洗滌組織塊數(shù)次。

2. 加入分散酶（0.6 至 2.4 單位/ml，溶解在不含鈣和鎂的平衡鹽溶液中）。

3. 在 37°C 下孵育 20 分鐘至數(shù)小時(shí)。

4. 通過(guò)無(wú)菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸液，將分散細(xì)胞和組織碎片與較大的組織塊分開(kāi)。如果需要進(jìn)一步 的解聚，在組織塊中加入新鮮的分散酶。

5. 通過(guò)離心在平衡鹽溶液中洗滌懸液數(shù)次。

為您的細(xì)胞類(lèi)型選擇正確的膠原酶

分散酶

分散酶或中性蛋白酶是多粘芽孢桿菌產(chǎn)生的金屬酶?？焖佟睾偷姆稚⒚缚捎糜谑斋@和轉(zhuǎn)移正常的二倍體細(xì)胞和細(xì)胞系。分散酶可有效分離細(xì)胞團(tuán)塊并從完整組織中分裂細(xì)胞，對(duì)膜完整性或活力幾乎沒(méi)有影響。

非酶細(xì)胞解離

Versene 溶液

Versene 溶液是 PBS 中的 EDTA 溶液，可溫和、非酶地解離細(xì)胞。這種螯合劑將某些細(xì)胞類(lèi)型（如上皮細(xì)胞）從血管表面分離以進(jìn)行懸浮。也可以用作胰蛋白酶消化前的洗滌劑。

非酶細(xì)胞解離緩沖液

推薦用于弱貼壁細(xì)胞（如上皮細(xì)胞），Gibco 細(xì)胞解離緩沖液可溫和解離并保持表面蛋白完整性。適合的應(yīng)用包括參與配體結(jié)合的細(xì)胞、流式細(xì)胞和免疫組織化學(xué)研究。

無(wú)酶細(xì)胞解離緩沖液實(shí)驗(yàn)方案：

以下是從基質(zhì)中快速移取各種細(xì)胞系同時(shí)保持細(xì)胞完整性的一種常規(guī)程序。此程序并不普遍適用于所有細(xì)胞系。應(yīng)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定各系統(tǒng)的條件和濃度。 在傳代培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)定期監(jiān)測(cè)細(xì)胞活力。細(xì)胞活力應(yīng)大于 90%。

1. 使用前將所有試劑加熱至 37°C。

2. 去除細(xì)胞中的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。

3. 沖洗單層細(xì)胞，每個(gè) T75 培養(yǎng)瓶或 100 mm 培養(yǎng)皿使用 5 ml 不含 Ca++ 和 Mg++ 的 PBS。輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶（或培養(yǎng)皿），使溶液在室溫下將細(xì)胞洗滌30至60秒。吸出沖洗液并丟棄。

4. 重復(fù)步驟3。

5. 每個(gè) T75 培養(yǎng)瓶或 100 mm 培養(yǎng)皿中加入大約 5 ml 細(xì)胞解離緩沖液，然后通過(guò)在室溫下?lián)u動(dòng)來(lái)輕柔地將細(xì)胞洗滌1至2分鐘。您可以在顯微鏡下觀(guān)察解離情況。 吸出溶液并丟棄。

6. 用手掌用力拍打培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿，使細(xì)胞脫落。如果細(xì)胞不能快速脫附，則在室溫下再放置2至5分鐘，再次用手掌用力拍打培養(yǎng)瓶。對(duì)于貼壁能力更強(qiáng)的細(xì)胞（使用 5 ml 以上的解離緩沖液），可能需要重復(fù)此操作。細(xì)胞明顯脫附后，加入至少 5 ml 生長(zhǎng)培養(yǎng)基。將細(xì)胞重懸于生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。

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