細胞凋亡（apoptosis）指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡。細胞凋亡與細胞壞死不同，細胞凋亡不是一件被動的過程，而是主動過程，它涉及一系列基因的激活、表達以及調(diào)控等的作用，它并不是病理條件下，自體損傷的一種現(xiàn)象，而是為更好地適應生存環(huán)境而主動爭取的一種死亡過程。下面介紹幾種常用的檢測細胞凋亡的方法。

     一、TUNEL法

      脫氧核糖核苷酸衍生物digoxin在TdT酶的作用下，可以摻入到凋亡細胞雙鏈或單鏈DNA的3-OH末端，與dATP形成異多聚體，并可與連接了報告酶（過氧化物酶或堿性磷酸酶）的抗digoxin抗體結合。在適合底物存在下，過氧化物酶可產(chǎn)生很強的顏色反應，精確地定位出正在凋亡的細胞，因而可在普通光學顯微鏡下進行觀察。洋地黃植物是digoxin的原料來源，在所有動物組織中幾乎不存在能與抗digoxin抗體結合的配體，因而非特異性反應很低?？?/span>digoxin的特異性抗體與脊椎動物非類固醇激素的交叉反應不到1%，若此抗體的Fc部分通過蛋白酶水解的方法除去后，則可*排除細胞Fc受體非特異性的吸附作用。本方法可以用于福爾馬林固定的石蠟包埋的組織切片、冰凍切片和培養(yǎng)的或從組織中分離的細胞凋亡檢測。

      在進行TUNEL法檢測細胞凋亡的實驗中，需設置陽性和陰性對照組，陽性對照的片子可使用DNase I部分降解的標本，陽性細胞對照可使用地塞米松處理的大、小鼠胸腺細胞或人外周血淋巴細胞。陰性對照不加TdT酶，其余步驟與實驗組相同。現(xiàn)在商品化的TUNEL試劑盒很多，可供選擇，除了DAB顯色法，還有熒光標記等方法的試劑盒可以選擇，可根據(jù)實驗需求選擇合適的試劑盒來完成細胞凋亡的檢測。

     二、流式細胞儀檢測細胞凋亡

     Y 啶橙染色法( Acridine Orange ,AO)：

     AO 可將細胞或細胞核中的雙鏈DNA 和變性DNA 染成不同顏色的熒光。AO 插入雙鏈DNA 中時,發(fā)綠色熒光;AO也可與單鏈或通過變性而產(chǎn)生的DNA 單鏈發(fā)生作用,這時發(fā)出紅色熒光,因此,通過FCM 檢測不同的熒光,可判斷凋亡的發(fā)生。在測定被標準化后,綠色和紅色熒光強度的量與總DNA 含量成比例,紅色熒光與總體細胞(紅色加綠色) 熒光的比率表示細胞中變性DNA 的比例,因此,這種方法可用于評價DNA 對原位變性的敏感性。有時候,凋亡細胞DNA 降解不明顯,依賴于DNA 降解來檢測細胞凋亡的方法如細胞DNA含量測定、DNA 末端標記等就難以檢測到細胞凋亡變化。AO法檢測凋亡的原理不依賴于DNA 片斷的產(chǎn)生,因此其最主要的優(yōu)點是可應用于寡核小體片段與凋亡不相平衡等情況,但AO 染色法不能有效區(qū)分有絲分裂細胞和凋亡細胞。

     若丹明( Rh123) 染色法：

     細胞生活狀態(tài)下,胞膜上的鈉- 鉀泵、鈣泵等的作用,使細胞膜內(nèi)外維持著不同離子的濃度梯度,包括Na + , K+ ,Cl - ,Ca2 + 等,形成細胞膜電位。FCM 可以檢測親脂性離子熒光染料在胞膜內(nèi)外的分布,來測量膜電位的高低,以評價細胞的活力。Rh123 是一種親脂性陽離子熒光染料,對細胞膜具有通透性,線粒體膜尤敏感。細胞存活狀態(tài)時,若丹明123 通過細胞膜,積聚于線粒體發(fā)出綠色熒光。在細胞凋亡時,線粒體膜的轉運能力下降,電負性降低,故細胞線粒體積聚Rh123 的能力也喪失,熒光強度降低,據(jù)此檢測細胞的凋亡變化。但應指出,在凋亡的早期階段,由于胞膜尚完整,大多數(shù)細胞器和細胞功能相對較好,因此,Rh123 法對于早期凋亡細胞和活細胞的鑒別比較困難。

     Annexin V-PI雙染色法：

     1992 年Fadok 報道在APO 早期位于細胞膜內(nèi)側的磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserin ,PS) 遷移至細胞外側,這一現(xiàn)象出現(xiàn)在核染色質變性與核體積縮小之前。AnnexinV 是一種具有很強的抗凝血特性的血管蛋白,和磷脂有高親合力,尤其與帶負電荷的磷脂如PS 具*的結合力,利用其特性可以檢測細胞凋亡。但壞死細胞PS 亦暴露于外表使Annexin V 結合陽性,因此使用Annexin V 這一參數(shù)不能區(qū)分壞死或凋亡,必須同時采用PI 這一參數(shù)將壞死細膽區(qū)分開來。FCM 通過Annexin V —FITC 標志暴露于細胞膜上的PS 結合PI 進入損傷細胞膜標記降解DNA 分析凋亡與壞死細胞。在檢測時有4個亞群包括機械性損傷細胞(Annexin - / P1 + ) 、正常細胞(An2nexin - / PI - ) 、凋亡細胞(Annexin + / PI - ) 和繼發(fā)性壞死細胞(Annexin + / PI + ) 被區(qū)分。Boersma 等應用Ampexin V2FITE染色法檢測細胞處理后的中國倉鼠細胞凋亡變化,FCM 檢測發(fā)現(xiàn)熒光信號強弱不同的兩種細胞亞群。進一步形態(tài)學等證實弱熒光細胞亞群代表早期凋亡細胞,強熒光亞群代表晚期凋亡細胞,可見其是檢測和定量凋亡細胞的一種較為可靠的方法。細胞凋亡時膜上PS 外露早于DNA 斷裂發(fā)生,因此該法檢測早期凋亡更為靈敏,且該法不需要固定細胞,避免了PI 法因固定造成的細胞碎片過多及TUNEL 法因固定出現(xiàn)的DNA 片段丟失,因此更加省時,結果亦更可靠,是目前最為理想的凋亡定量檢測方法。

儀器推薦：CO2培養(yǎng)箱