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武漢原生原代生物醫(yī)藥科技有限公司

PriCells: 用差速離心法從大鼠肝臟中分離原代細胞重線粒體組分

時間:2021-11-4 閱讀:285
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PriCells: 用差速離心法從大鼠肝臟中分離原代細胞重線粒體組分                       


試劑和器材
1. 甘露醇緩沖液:0.2mol/L甘露醇、50mmol/L蔗糖溶液、10mmol/L KCl、1mmol/L乙二胺四乙酸、10mmol/L Hepes-NaOH,pH7.4;
2. 玻璃棒;
3. Dounce勻漿器(20—30ml寬松配制,Wheaton B型);
4. 高轉矩橋式電動機(半導體開關控制);
5. 高速離心機,配有可容納40—50ml離心管的固定角轉子低速冷凍離心機;
6. Potter-Elvehjem勻漿器,20—40ml間隙為0.07mm;
7. 注射器(內徑約0.8mm),帶金屬套管針;


實驗方法:
   所給體積適用于約10g的肝臟。第6步以后所有操作須在0—4℃下進行。
1. 對一雄性大鼠過夜禁食,使其糖原耗盡;
2. 頸椎脫臼法處死大鼠,迅速切除肝臟并稱重;
3. 將肝臟轉移到置于冰上的燒杯中,用剪刀小心地剪碎(肝臟碎片的大小不得超過3mm3),然后用甘露醇緩沖液混懸(每克肝臟使用約4ml緩沖液);
4. 將一半的液體和組織碎片倒入Potter-Elvehjem勻漿器,用研杵上下研磨5—6次(旋轉速度約為700r/min),另一半的樣品也重復該操作;
5. 將勻漿液平分到2個離心管中,并于1000g離心10min;
6. 傾倒上清后,放置在冰上。取30ml緩沖液重懸沉淀,用Potter-Elvehjem勻漿器的研杵研磨2—3次進行勻漿,并重復步驟5操作;
7. 傾倒后合并上清,再于1000g離心10min;
8. 用連在20ml注射器的金屬套管針去除上清;
9. 4000g離心上清15min;
10. 用金屬套管針和注射器去除4000g離心所得上清。為盡可能除去上清,針頭盡量靠近凹液面;
11. 同樣將致密的棕色沉淀上堆積的疏松粉紅色物質小心地吸出,用紙片擦拭管內壁以去除附著液體;
12. 每管加入10ml緩沖液,用玻璃棒攪拌自然狀態(tài)下重懸沉淀;
13. 在Dounce勻漿器中用研杵輕輕地研磨3次以完成重懸;
14. 用緩沖液補償?shù)皆w積,再傾倒至新管中;
15. 重復步驟9—14 3次;
16. 最后,將純化了的重線粒體重懸于合適的介質中(與后序分析相一致);

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