PriCells: 原代細(xì)胞核孔復(fù)合物的分離                                                           

試劑和器材： 
1. 肝素；
2. 苯j(luò)ia基磺酰氟（PMSF）（溶于乙醇中配制成1mol/L儲(chǔ)存液）；
3. 純化的核膜；
4. 提取緩沖液（EB）：含1%（體積分?jǐn)?shù)）Triton X-100的10mmol/L Tris-HCl，（pH7.4）、0.1mmol/L苯j(luò)ia基磺酰氟；
5. Tris緩沖液：2mmol/L Tris-HCl、pH7.4，10mmol/L Tris-HCl、pH7.4；
6. 梯度溶液：0.25mol/L蔗糖溶液和1.5mol/L蔗糖溶液溶于10mmol/L Tris-HCl，pH7.4；
7. 所有溶液須含0.1mmol/L苯j(luò)ia基磺酰氟；
8. 梯度收集器；
9. 高速離心機(jī)，配有固定角轉(zhuǎn)子和離心管；
10. 超速離心機(jī)，配有固定角和吊桶式轉(zhuǎn)子、離心管；
11. 超聲發(fā)生器（探針型，帶有定時(shí)器）；
12. 雙室梯度儀或者Gradient MasterTM；

實(shí)驗(yàn)方法：
1. 采用提取緩沖液，4℃抽提原代細(xì)胞核膜30min；
2. 20000g離心30min，松散地沉淀核孔復(fù)合物薄片。用2mmol/L Tris-HCl、（pH7.4）小心重懸沉淀，再次離心；
3. 用10mmol/L的Tris-HCl（pH7.4）小體積重懸沉淀（如1ml），并在冰浴上超聲處理。為防止樣品產(chǎn)熱，超聲過程中重復(fù)短時(shí)間處理（如10s），中間間隔冷卻；
4. 通過制備負(fù)染標(biāo)本，如用20g/L鉬酸銨（pH7.0）或50g/L鉬酸銨-1g/L海藻糖（pH7.0）進(jìn)行電鏡分析，及時(shí)監(jiān)測核膜的破裂以及核孔復(fù)合物的釋放。如果必要的話，繼續(xù)超聲處理；
5. 將樣品加于0.25—1.5mol/L蔗糖-10mmol/L Tris-HCl（pH7.4）線性密度梯度溶液上，4℃、約60000g離心1—2h；
6. 從蔗糖梯度溶液中部分收集；
7. 采用負(fù)染電鏡檢測收集各成分內(nèi)容物，以確定核孔復(fù)合物沉淀在蔗糖梯度溶液中的位置，并進(jìn)行完整性分析；
8. 對(duì)梯度成分進(jìn)行SDS-PAGE，檢測蛋白分離情況；