PriCells: DPSCs/SHED的原代培養(yǎng)                                                              

Stem cells from human exfoliated deciduous teeth (SHED)

Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs)

試劑和材料：
1. 無鎂和鈣的PBS平衡鹽溶液（PBSA）；
2. MSC培養(yǎng)基：含2mmol/L 谷氨酰胺的α-MEM，添加15%胎牛血清，0.1mmol/L左旋抗壞血酸磷酸鹽，100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素；
3. Ⅰ型膠原酶；
4. 中性蛋白酶；
5. 免疫磁珠分選時(shí)所需試劑；
（1） 含1%BSA的PBSA
（2） 與DPSC反應(yīng)的一抗，用STRO-1（小鼠抗人MSC；IgM），CC9（小鼠抗人CD146/MUC-18；IgG2a），或3G5（小鼠抗人外膜細(xì)胞；IgM）
（3） 羊抗小鼠IgG-結(jié)合或大鼠抗小鼠IgM-結(jié)合磁珠
6. 培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿；
7. 手術(shù)刀片和刀柄；
8. 70μm細(xì)胞濾網(wǎng)；
9. 回轉(zhuǎn)式混合儀；
10. Dynal MPCR-1磁分離器

實(shí)驗(yàn)方法：
1. 用手術(shù)刀片將牙髓組織切成小碎片；
2. 將剪碎的組織放入膠原酶/中性蛋白酶混合溶液中（1：1）；
3. 37℃孵育30—60min，間歇地?fù)u勻組織/消化酶混合物；
4. 消化后，加入足夠的MSC培養(yǎng)基，終止酶的活性；
5. 將懸液經(jīng)70μm細(xì)胞濾膜過濾，去除細(xì)胞碎片，得到單細(xì)胞懸液；
6. 500g離心6min；
7. 倒掉上清液，用MSC培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。然后進(jìn)行免疫磁珠分選；
（1） 和能與DPSC細(xì)胞反應(yīng)的一抗孵育，包括STRO-1（小鼠抗人MSC；IgM），CC9（小鼠抗人CD146/MUC-18；IgG2a），或3G5（小鼠抗人外膜細(xì)胞；IgM），20μg/ml，冰上孵育1h；
（2） 用含1%BSA的PBSA洗兩遍，600g離心6min；
（3） 羊抗小鼠IgG-結(jié)合或大鼠抗小鼠IgM-結(jié)合磁珠的任意一個(gè)二抗孵育，4℃回轉(zhuǎn)式混合儀40min；
（4） 根據(jù)產(chǎn)品說明書推薦的方案，通過Dynal MPCR-1磁分離器分離結(jié)合磁珠的細(xì)胞；
8. 細(xì)胞計(jì)數(shù)，按（1×10）×10³個(gè)細(xì)胞/cm²密度接種到培養(yǎng)瓶或皿上；
9. 在MSC培養(yǎng)基、37℃和5%CO_²的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
10. 細(xì)胞分離后7天，用PBSA洗培養(yǎng)瓶，更換培養(yǎng)基。之后可以一周兩次更換培養(yǎng)基，直至細(xì)胞達(dá)到匯合；