3T3-L1細(xì)胞培養(yǎng)基的核心配方為DMEM高糖培養(yǎng)基，需添加10%胎牛血清(FBS)或小牛血清(CS)及1%青霉素-鏈霉素(P/S)，培養(yǎng)條件為37℃、5% CO?恒溫培養(yǎng)箱。
3T3-L1細(xì)胞培養(yǎng)基具體說(shuō)明：
一、基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分
DMEM高糖培養(yǎng)基
核心成分：含葡萄糖(4.5g/L)、氨基酸、維生素及無(wú)機(jī)鹽，為細(xì)胞提供基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)。
NaHCO?緩沖系統(tǒng)：維持培養(yǎng)基pH穩(wěn)定(通常含1.5g/L NaHCO?)，需配合5% CO?環(huán)境使用。
血清補(bǔ)充
胎牛血清(FBS)或小牛血清(CS)：
濃度：10%(常規(guī)培養(yǎng))或2%(誘導(dǎo)前預(yù)處理，用于降低血清依賴性)。
作用：提供生長(zhǎng)因子、激素及貼壁因子，促進(jìn)細(xì)胞增殖與分化。
替代方案：若需標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)，可使用化學(xué)成分明確的培養(yǎng)基(如Serum-Free Media)，但需額外補(bǔ)充脂質(zhì)、轉(zhuǎn)鐵蛋白等成分。
抗生素
青霉素-鏈霉素(P/S)：
濃度：1%(100U/mL青霉素+100μg/mL鏈霉素)。
作用：預(yù)防細(xì)菌污染，但需注意長(zhǎng)期使用可能影響細(xì)胞代謝。
其他添加劑
GlutaMAX-1谷氨酰胺：替代L-谷氨酰胺，穩(wěn)定性更高，減少氨毒性。
MEM NEAA非必需氨基酸：補(bǔ)充非必需氨基酸，支持細(xì)胞快速增殖。
Sodium Pyruvate丙酮酸鈉：作為能量補(bǔ)充劑，增強(qiáng)細(xì)胞代謝活性。
二、培養(yǎng)條件優(yōu)化
環(huán)境控制
溫度：37℃(恒溫培養(yǎng)箱)。
氣體：95%空氣+5% CO?(維持pH穩(wěn)定)。
濕度：70%-80%(防止培養(yǎng)基蒸發(fā))。
細(xì)胞密度管理
傳代時(shí)機(jī)：匯合度達(dá)70%-80%時(shí)傳代，避免過(guò)度融合導(dǎo)致分化抑制。
接種密度：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞按2.0×10? cells/cm²接種，確保均勻生長(zhǎng)。
傳代操作
消化液：0.25% Trypsin-EDTA，消化1-2分鐘(顯微鏡下觀察細(xì)胞變圓后終止)。
離心條件：1000rpm×5min，去除消化液及代謝廢物。
鋪板均勻性：傳代時(shí)輕柔吹打，避免細(xì)胞團(tuán)塊形成，確保分化一致性。
三、成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基
誘導(dǎo)階段
接觸抑制：細(xì)胞長(zhǎng)滿至100%融合后，靜置2天使細(xì)胞進(jìn)入生長(zhǎng)停滯期。
誘導(dǎo)液A：DMEM+10% FBS+0.5mM IBMX+1μM DEX+10μg/mL胰島素，培養(yǎng)2天。
誘導(dǎo)液B：DMEM+10% FBS+10μg/mL胰島素，培養(yǎng)4-6天(每2天換液一次)。
關(guān)鍵成分作用
IBMX：磷酸二酯酶抑制劑，提高細(xì)胞內(nèi)cAMP水平，激活PKA通路。
DEX：糖皮質(zhì)激素，誘導(dǎo)C/EBPβ表達(dá)，啟動(dòng)成脂程序。
胰島素：促進(jìn)葡萄糖攝取與脂質(zhì)合成，維持分化后細(xì)胞功能。
分化成功標(biāo)志
形態(tài)學(xué)：細(xì)胞變圓，形成脂滴(油紅O染色呈紅色或橘紅色)。
分子標(biāo)志：PPARγ、C/EBPα、FABP4等基因表達(dá)上調(diào)。
四、質(zhì)量控制與注意事項(xiàng)
無(wú)菌操作
培養(yǎng)基配制時(shí)需嚴(yán)格無(wú)菌，誘導(dǎo)劑分裝后-20℃保存，避免反復(fù)凍融。
細(xì)胞操作全程在超凈工作臺(tái)內(nèi)完成，使用前紫外線照射30分鐘。
細(xì)胞狀態(tài)監(jiān)測(cè)
定期觀察：顯微鏡下檢查細(xì)胞形態(tài)、貼壁情況及污染跡象。
生長(zhǎng)曲線繪制：通過(guò)MTT法或細(xì)胞計(jì)數(shù)儀監(jiān)測(cè)增殖速率，優(yōu)化傳代周期。
常見(jiàn)問(wèn)題解決
貼壁差：使用0.1%明膠包被培養(yǎng)底面，或增加血清濃度至15%。
誘導(dǎo)效率低：檢查細(xì)胞代數(shù)(建議使用P5-P15代細(xì)胞)，或增加DEX濃度至2μM。
污染處理：立即丟棄污染細(xì)胞，消毒培養(yǎng)箱及超凈工作臺(tái)。
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