2-8℃避光

1.MMP-1 底物短期 4°C避光保存，長期-20℃℃避光保存:。 2.MMP-1 底物在冬季氣溫較低時在室溫時為凝固狀態(tài)，極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需要 加熱融解，吸頭也需要放在培養(yǎng)箱預(yù)熱，否者容易再次凝固在吸頭內(nèi)壁產(chǎn)生損耗。融解后離 心至管底部再打開螺旋蓋。 3.可以用手捂住使其融解或 37°C短時間水浴， 4.有效期為試劑盒未拆封前按要求條件保存的有效期。 5.試劑拆封后請盡快使用完。

一年

熒光酶標(biāo)儀/熒光光度計

細(xì)胞/組織

1.熒光酶標(biāo)儀/熒光光度計； 2.離心機(jī)； 3.移液器； 4.冰箱； 5.冰盒；

1.PBS; 2.蛋白定量試劑盒

1.離心管； 2.吸頭； 3.一次性手套； 4.熒光檢測專用的黑色96孔板

1.37℃℃下反應(yīng)如果顏色變化不明顯，可以適當(dāng)延長反應(yīng)時間。 2.如果樣品中蛋白含量低，加大樣品量，裂解樣品時需設(shè)法使樣品中的蛋白量達(dá)到 200-500 ug每樣。 3.如果樣品中激活的MMP水平很低，適當(dāng)調(diào)節(jié)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的時間，找一個 MMP 激活比較強(qiáng)的時間點(diǎn)進(jìn)行檢測。 4.MMP-1 底物避光保存，使用過程中盡量避光。 5.底物為 DMSO 溶液，冬季氣溫較低時在室溫時為凝固狀態(tài)，極易粘附在管壁、吸頭壁。注意需 要加熱溶解，吸頭也需要放在培養(yǎng)箱預(yù)熱，否者容易再次凝固在吸頭內(nèi)壁產(chǎn)生損耗。 6.使用前，先將本品取出回溫至室溫，并對其進(jìn)行簡短離心使 DMSO 溶液集中于管底。 7.酶標(biāo)儀檢測必須使用熒光檢測專用的黑色 96 孔板。

一、裂解緩沖液和檢測緩沖液配制 根據(jù)待測樣品數(shù)準(zhǔn)備裂解緩沖液和檢測緩沖液，每1ml緩沖液中加入 10 ul DTT 充分混勻置冰上備用。 二、樣品處理 A.細(xì)胞樣品 1.收集 5x10（6次方）個細(xì)胞，在 4℃，500xg 條件下離心5分鐘，小心吸取培養(yǎng)基，盡可 能吸干，收集細(xì)胞。 2.用冷 PBS 洗滌細(xì)胞兩次，每次洗滌后盡可能吸干上清。 3.在細(xì)胞中加入 50 ul冷的裂解緩沖液，高速渦旋振蕩15 秒。 4.置冰上持續(xù)振蕩 20-45 分鐘。 5.在 4℃，12000xg 條件下離心 15 分鐘。 6.快速將上清吸入另一預(yù)冷的干凈離心管，置于冰上保存?zhèn)溆? B組織樣品 1.取適量組織樣本剪碎，按照每 50 mg/100 ul冷的裂解緩沖液，用組織勻漿器勻 漿至無明顯肉眼可見固體，冰上振蕩 20-45 分鐘，小心將上清吸入另一預(yù)冷的 干凈離心管。 2. 在 4℃，12000xg條件下離心5分鐘。 3.快速將上清吸入另一預(yù)冷的干凈離心管，置于冰上或-80℃冰箱保存?zhèn)溆? 三、對上述處理過的上清進(jìn)行蛋白定量。 【注】: 1.必須進(jìn)行蛋白定量，以保證后續(xù)步驟的蛋白上樣量足夠，否則容易出現(xiàn)檢測不到結(jié)果的 情況。 2.用 BCA 蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量的話，裂解液中不要加入 DTT。 四、MMP1活性檢測 1.取 50ul 裂解上清(含 100-200 ug 蛋白)，加入 45ul 檢測緩沖液。 2.再加入 5 ul MMP-1 熒光底物，充分混勻，在 37℃下避光反應(yīng) 1-2 小時。 3.熒光酶標(biāo)儀檢測熒光強(qiáng)度。Ex=325 nm，Em=400 nm。 4.根據(jù)凋亡的細(xì)胞的熒光值與對照細(xì)胞樣本的熒光值的比值計算相對的MMP1 活性程度變化。

熒光強(qiáng)度值偏低 MMP-1活性檢測方法常見的問題主要為測得的熒光強(qiáng)度值偏低，趨勢不明顯，無 結(jié)果，無法顯示與對照組細(xì)胞的差異等，其可能的原因主要集中在以下幾個方面: 1.樣品上樣量不夠:本方法檢測需要的細(xì)胞數(shù)量須在3x10（6次方）以上，或者新鮮組織 50 mg 以上，每次反應(yīng)的蛋白量需要在 100 μg 以上。如果量不夠，請增加細(xì) 胞或組織的量。 2.樣本不新鮮:使用新鮮的細(xì)胞或組織樣本。 3.樣品裂解不夠充分:細(xì)胞或組織需要進(jìn)行充分裂解，可以加入適當(dāng)?shù)牡?白酶抑制劑混合物裂解，裂解后應(yīng)無明顯大量的沉淀，以保證有效獲得蛋白。 4.樣品中激活的 MMP-1 水平偏低:首先確認(rèn)模型的凋亡現(xiàn)象是否明顯，以及根 據(jù)文獻(xiàn)和其他驗證方法確認(rèn)該凋亡是否激活 MMP-1。 5.檢測時間點(diǎn)的選擇是否合適:不論哪種通路的凋亡，需要在MMP-1被有效激 活并達(dá)到相應(yīng)活化程度后的一定時間范圍內(nèi)檢測，過早或過晚均不合適。 6.不適合本方法檢測:某些凋亡誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的凋亡可能是非依賴于 MMP-1活化 的機(jī)制，此種情況時利用本試劑盒檢測 MMP-1無明顯變化，需要考慮凋亡機(jī) 制的其他通路。